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Observer les processus dynamiques dans les cellules : comment l’imagerie par fluorescence nous aide-t-elle à comprendre l’expression des gènes ?
L’imagerie par fluorescence est une technique d’imagerie non invasive qui nous aide à visualiser les processus biologiques se produisant dans les organismes vivants. Cette technique utilise une variété de méthodes, notamment la microscopie, les sondes d’imagerie et la spectroscopie pour générer des images. La fluorescence est essentiellement un phénomène de luminescence qui se produit lorsqu'une substance absorbe un rayonnement électromagnétique puis libère une lumière d'une longueur d'onde spécifique. Les molécules qui peuvent émettre de la lumière sont appelées fluorophores. L'imagerie par fluorescence utilise des colorants fluorescents et des protéines fluorescentes pour marquer les machines et les structures moléculaires, permettant l'observation expérimentale des processus dynamiques de l'expression des gènes, de l'expression des protéines et des interactions moléculaires.
L'imagerie par fluorescence fournit un outil quantitatif précis pour les applications biochimiques.
Il existe souvent un malentendu entre la fluorescence et la bioluminescence, la différence entre les deux étant le processus protéique qui produit la lumière. La bioluminescence est un processus chimique impliquant des enzymes décomposant des substrats pour produire de la lumière, tandis que la fluorescence est l'excitation physique des électrons suivie de leur retour à l'état fondamental pour libérer de la lumière.
Mécanisme de fluorescence
Lorsqu'une molécule absorbe de la lumière, l'énergie de la molécule monte brièvement vers un état plus excité. Lorsqu'il revient ensuite à son état fondamental, il émet une lumière fluorescente, qui peut être détectée et mesurée. La longueur d'onde spécifique de la lumière émise dépend de l'énergie des photons absorbés, cette longueur d'onde doit donc être connue à l'avance dans l'expérience afin que l'équipement de mesure puisse détecter correctement la génération de lumière.
La formule permettant de déterminer la longueur d'onde d'émission de fluorescence est : émission λ = hc / émission d'énergie
Ici, h est la constante de Planck et c est la vitesse de la lumière. Généralement, un grand dispositif de balayage ou CCD est utilisé pour mesurer l'intensité et numériser l'image.
Colorants fluorescents et protéines
Les colorants fluorescents ont une photostabilité et une luminosité plus élevées et ne nécessitent pas de temps de maturation par rapport aux protéines fluorescentes. En termes de luminosité, le coefficient d'extinction (la capacité à absorber la lumière) et l'efficacité quantique (la façon dont il convertit la lumière absorbée en lumière fluorescente) d'un fluorophore sont étroitement liés. Le colorant lui-même n’est pas très fluorescent, mais lorsqu’il est lié à une protéine, il devient plus détectable. Par exemple, NanoOrange peut se lier au revêtement et aux régions hydrophobes des protéines et n’est pas affecté par les agents réducteurs.
Les protéines peuvent s'autofluorescer lorsqu'elles absorbent la lumière incidente d'une longueur d'onde spécifique. Par exemple, la protéine fluorescente verte (GFP) émet une lumière verte lorsqu’elle est exposée à une lumière allant du bleu à l’ultraviolet. Les protéines fluorescentes sont d’excellentes molécules rapporteuses qui aident à localiser les protéines, à observer la liaison des protéines et à quantifier l’expression des gènes.
Plage d'imagerie
Étant donné que certaines longueurs d’onde de fluorescence sont hors de portée de l’œil humain, le CCD est utilisé pour détecter avec précision la lumière et former une image. Cela se fait généralement dans la gamme 300–800 nm. L’un des avantages des signaux de fluorescence est que la relation entre l’intensité de la lumière émise et le nombre de molécules fluorescentes présentes est généralement linéaire, ce qui nécessite essentiellement que l’intensité de la lumière incidente et la longueur d’onde restent constantes. L'image finale est généralement rendue au format de données 12 bits ou 16 bits.
Système d'imagerie
Les principaux composants d'un système d'imagerie par fluorescence comprennent : une source d'excitation (qui peut produire une lumière à large longueur d'onde ou une lumière laser), une optique d'affichage de la lumière (utilisée pour éclairer l'échantillon) et une optique de collecte de lumière (généralement composée de lentilles, de miroirs et de filtres). ), ainsi que des dispositifs de détection, d’amplification et de visualisation (tels que des tubes photomultiplicateurs ou CCD).Applications
L'imagerie par fluorescence a été largement utilisée dans différents domaines scientifiques, notamment :
- SYBR Green est un colorant couramment utilisé pour visualiser les bandes d'ADN en PCR (électrophorèse sur gel d'agarose).
- Utiliser l’imagerie par fluorescence pour faciliter la navigation lors de la transplantation. Par exemple, la sarcelle indienne peut être utilisée chez les patients atteints de cancer pour détecter les ganglions lymphatiques.
- En imagerie calcique, des molécules fluorescentes sont utilisées pour surveiller l’activité des cellules vivantes du système nerveux.
Avantages et inconvénients
Bien que l'imagerie par fluorescence présente certains avantages, tels qu'un fonctionnement non invasif et une sensibilité élevée, elle présente également certains défis, tels que le blanchiment par fluorescence, la sensibilité environnementale et des capacités de résolution limitées.Orientations futures
Les scientifiques travaillent au développement de protéines fluorescentes plus efficaces pour améliorer les performances des sondes d’imagerie. Grâce à des méthodes telles que le génie génétique et la stabilisation de l’environnement, la future technologie d’imagerie par fluorescence devrait permettre des percées dans de multiples dimensions.
L'imagerie par fluorescence offre un large éventail de possibilités pour explorer ce qui se passe à l'intérieur des cellules. Quels nouveaux phénomènes biologiques les futures découvertes pourraient-elles révéler ?
