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Les utilisations étonnantes de la microscopie FLIM : comment obtenir des images à ultra-haute résolution en détection en temps réel ?
Alors que la science et la technologie progressent à un rythme rapide, la technologie des microscopes innove également en permanence. Parmi eux, la microscopie d'imagerie à durée de vie de fluorescence (FLIM) est devenue un outil important dans la recherche en sciences de la vie et des matériaux en raison de son principe d'imagerie unique et de ses applications pratiques. Contrairement à la microscopie traditionnelle, qui utilise l’intensité de fluorescence comme base d’imagerie, FLIM génère des images basées sur la vitesse à laquelle les molécules fluorescentes reviennent d’un état excité à un état fondamental, plutôt que sur leur intensité.
En mesurant la durée de vie de la fluorescence, FLIM élimine non seulement les erreurs de mesure causées par les variations de luminosité de la source lumineuse, l'intensité de la lumière de fond ou le photoblanchiment, mais minimise également les effets de la diffusion des photons dans les couches épaisses de l'échantillon.
« Le changement de la durée de vie de la fluorescence dépend du microenvironnement local de la molécule fluorescente et peut donc servir d'indicateur du pH, de la viscosité et de la concentration chimique, entre autres. »
Principes de base de la durée de vie de la fluorescence
Lorsqu'elles sont excitées par des photons, les molécules de photons reviennent à l'état fondamental avec différentes probabilités via le rayonnement électromagnétique et les voies de désintégration non radiative. Seule la voie impliquant l’émission spontanée de photons conduit à la formation de fluorescence. Selon la loi de Schott, l'expression mathématique de la décroissance de l'intensité de fluorescence au cours du temps peut être simplifiée en une fonction exponentielle. Cela montre que la durée de vie de la fluorescence est une quantité physique indépendante de l’intensité initiale.
Technologie de mesure et de mise en œuvre FLIM
Dans FLIM, l'instrument utilise une source d'excitation pulsée puis enregistre la courbe de décroissance via la fonction de réponse de la machine. Lorsqu'un groupe de molécules fluorescentes est excité par une impulsion lumineuse ultracourte, la fluorescence résolue dans le temps qui en résulte présentera inévitablement une décroissance exponentielle. L’implémentation la plus courante est basée sur le comptage de photons uniques corrélés dans le temps (TCSPC), une technique qui améliore la précision des mesures et minimise l’impact du bruit de fond.
« En utilisant un équipement TCSPC commercial, la résolution temporelle de la courbe de décroissance de la fluorescence peut atteindre 405 femtosecondes. »
Champ d'application
La technologie FLIM offre des avantages uniques dans l’étude des cellules vivantes et de leur microenvironnement. Cette technologie permet de distinguer différents mouvements moléculaires à l’échelle nanométrique et peut être utilisée pour étudier les interactions biomoléculaires, les changements dans l’activité enzymatique intracellulaire, etc.
Ces dernières années, la technologie FLIM a été davantage appliquée au diagnostic médical, en particulier dans la chirurgie des tumeurs cérébrales, où elle peut être combinée avec des endoscopes pour mettre en œuvre un diagnostic en temps réel. En mesurant la durée de vie de la fluorescence du tissu tumoral, les médecins peuvent évaluer plus précisément les limites et les propriétés de la tumeur.
Analyse des données et perspectives d'avenir
Dans l'analyse d'images FLIM, l'extraction de courbes de décroissance pure et l'estimation de la durée de vie de la fluorescence sont des tâches clés. À cet égard, une variété d’algorithmes ont été proposés, qu’il s’agisse de la méthode des moindres carrés ou de la méthode de détermination rapide de la durée de vie, ils améliorent constamment la précision et la praticité du calcul.
« Le développement de ces méthodes a transformé la FLIM d'une théorie de laboratoire en une méthode plus pratique et plus pratique, permettant à cette technologie d'entrer dans la clinique. »
Avec l’avancement de la technologie, la vitesse d’acquisition d’images du FLIM continuera d’augmenter et le champ d’application s’élargira. Que ce soit en recherche scientifique fondamentale ou en diagnostic clinique, le potentiel de cette technologie ne peut être ignoré. Cependant, à mesure que ses domaines d’application s’élargissent, nous devons réfléchir à la manière de mieux combiner la technologie FLIM avec d’autres techniques pour promouvoir le développement et l’innovation de la biomédecine ?
