Language
Country/Area
No result found
Masa lalu dari sekuensing Sanger dan masa depan NGS: Bagaimana sequencing DNA berubah dari tunggal ke paralel?
Di bidang ilmu biomedis, teknologi sekuensing DNA telah mengalami perubahan signifikan.Sejak diperkenalkannya sekuensing Sanger, misteri genom telah diluncurkan untuk kita, dan kemunculan sekuensing generasi berikutnya (NGS) telah mendorong teknologi ini ke ketinggian baru.Lompatan teknologi ini dari tunggal ke paralel tidak hanya meningkatkan kecepatan sekuensing, tetapi juga mengurangi biaya pengurutan, sehingga mengubah lanskap penelitian genomik.
Munculnya NGS memungkinkan kita untuk mendapatkan puluhan juta data genom dalam periode waktu yang singkat, yang tak tertandingi dengan sekuensing Sanger.
NGS mengacu pada berbagai metode sekuensing DNA throughput tinggi yang memanfaatkan konsep pemrosesan paralel skala besar.Banyak dari teknologi ini muncul satu demi satu dari tahun 1993 hingga 1998 dan dikomersialkan pada tahun 2005.Teknologi ini memungkinkan setiap instrumen untuk menghasilkan dari 1 juta hingga 43 miliar urutan pendek dibaca saat dijalankan.Dalam platform ini, konfigurasi teknis dan kimia sekuensing berbeda, tetapi mereka berbagi paradigma teknis yang umum: sekuensing paralel skala besar melalui templat DNA yang diamplifikasi secara spasial atau molekul DNA tunggal.
Pada saat yang sama, sekuensing Sanger juga dikenal sebagai sekuensing generasi pertama, yang bergantung pada elektroforesis untuk memisahkan produk akhir.Meskipun metode ini memiliki sejarah panjang, tampaknya tidak bermoral ketika menghadapi kebutuhan ilmiah saat ini.Metodologi NGS memungkinkan kita untuk menyelesaikan pekerjaan sekuensing skala besar pada satu waktu, membawa efisiensi dan akurasi yang belum pernah terjadi sebelumnya untuk penelitian genetik.
platform NGS
Proses pengurutan DNA menggunakan platform NGS yang tersedia secara komersial biasanya dibagi menjadi beberapa langkah:
- Pustaka sekuensing DNA dihasilkan oleh amplifikasi klon PCR in vitro.
- Urutan DNA ditentukan oleh sekuensing sintetis berdasarkan peningkatan nukleotida pada untai pelengkap.
- Template DNA yang terisolasi secara spasial, diamplifikasi diurutkan secara bersamaan dengan cara paralel skala besar, tanpa perlu langkah pemisahan fisik.
Meskipun langkah -langkah ini serupa di sebagian besar platform NGS, strategi masing -masing platform bervariasi, yang membuat setiap teknologi unik dan area aplikasi di pasar.
Reaksi sekuensing NGS yang paraleli dapat menghasilkan ratusan mega hingga gigabit urutan nukleotida dibaca dalam satu instrumen.Perubahan ini sangat meningkatkan jumlah data urutan yang tersedia, menghasilkan perubahan mendasar dalam metode sekuensing genom ilmu kedokteran.Dengan munculnya teknologi dan instrumen NGS yang muncul, biaya pengurutan juga telah berkurang secara signifikan, mendekati standar hanya $ 1.000 per genom.
Metode Persiapan Template
Saat melakukan reaksi NGS, ada dua metode utama untuk menyiapkan templat: templat amplifikasi dari molekul DNA tunggal dan templat molekul DNA tunggal.
Untuk sistem pencitraan yang tidak dapat mendeteksi peristiwa fluoresen tunggal, templat DNA perlu diamplifikasi.Metode amplifikasi umum termasuk PCR emulsi, amplifikasi cincin bergulir dan amplifikasi fase padat.
lotion pcr
Dalam metode emulsi PCR, perpustakaan DNA pertama kali dihasilkan oleh fragmentasi acak DNA genom, dan kemudian fragmen DNA untai tunggal dihubungkan ke permukaan partikel dengan penghubung. mewakili fragmen DNA.Partikel-partikel tersebut kemudian dikemas ke dalam tetesan emulsi minyak air, yang masing-masing merupakan mikroreaktor PCR, di mana salinan templat DNA tunggal yang diamplifikasi diproduksi.
amplifikasi jembatan
Dalam amplifikasi jembatan, primer maju dan terbalik secara kovalen melekat pada substrat sel aliran pada kepadatan tinggi.Setelah reagen yang diperluas secara enzimatik terpapar, templat berpasangan meluas ke atas permukaan primer, akhirnya menyelesaikan amplifikasi lokal polimer DNA di jutaan lokasi yang berbeda, menjadi kluster templat independen.
template molekul tunggal
Persiapan templat molekul tunggal lebih intuitif dibandingkan, yang tidak memerlukan langkah PCR.Secara umum, templat molekul tunggal ditetapkan pada dukungan padat dan diamplifikasi dengan cara yang berbeda.Seperti pada pendekatan pertama, primer yang didistribusikan secara spasial diimobilisasi pada dukungan padat, dan fragmen DNA yang dibelah secara acak kemudian hibridisasi ke primer yang diimobilisasi.
Metode Sequencing
Metode pengurutan NG memiliki karakteristik mereka sendiri, termasuk sekuensing sintetis, pirosequencing dan kimia terminator yang dapat dibalik.Tujuan sekuensing sintetis adalah untuk menentukan urutan sampel dengan mendeteksi penambahan nukleotida DNA polimerase.
Bisa dibilang, setelah kehilangan langkah -langkah membosankan yang diperlukan untuk sekuensing Sanger tradisional, NGS memberikan paradigma yang lebih efisien untuk penelitian genomik.
Seiring perkembangan teknologi, kami telah menyaksikan transisi sekuensing DNA dari metode urutan tunggal awal ke model pemrosesan paralel saat ini, yang tidak hanya meningkatkan efisiensi, tetapi juga membawa keuntungan yang belum pernah terjadi sebelumnya dalam biaya dan waktu.Ke arah mana teknologi pengurutan DNA di masa depan akan berkembang?
