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La magia del test della cometa: perché il DNA si muove come una cometa durante l'elettroforesi?
Nel mondo della scienza, rilevare danni al DNA non è mai stato facile. Tuttavia, il test dell'elettroforesi su gelatina a singola cellula (noto anche come test della cometa) fornisce un metodo semplice e sensibile per rilevare danni al DNA nelle singole cellule eucariotiche. Questa tecnica è stata sviluppata per la prima volta da Östling e Johansson nel 1984 e poi migliorata da Singh et al. nel 1988. Da allora è diventata una delle tecniche standard per il danno/la riparazione del DNA, il monitoraggio ambientale e i test di mutagenicità.
Il test della cometa prende il nome dal modello di migrazione del DNA in un gel elettroforetico, che spesso assomiglia a una cometa.
Il protocollo di base per questo test prevede l'incapsulamento delle cellule in una sospensione di agarosio a basso punto di fusione, la successiva lisi delle cellule in condizioni neutre o alcaline (pH > 13) e l'elettroforesi delle cellule lisate sospese. Durante questo processo, viene esaminata la struttura del DNA della cellula, formando particolari modelli "a cometa" che riflettono l'entità del danno al DNA.
Come funziona
Il principio di base del test della cometa è che il DNA non danneggiato mantiene un'associazione altamente ordinata con le proteine della matrice nel nucleo cellulare e questa struttura viene interrotta quando il DNA viene danneggiato. I filamenti di DNA danneggiati perdono la loro struttura compatta e si rilassano, iniziando a espandersi nell'agarosio. Quando viene applicato un campo elettrico, il DNA caricato negativamente viene attratto dall'anodo caricato positivamente, creando così una forma a "cometa".
Quanto maggiore è il grado di danno, tanto più lunghe e luminose saranno le code di DNA, poiché più frammenti di DNA saranno in grado di essere rilasciati dalla cellula nell'agarosio.
Fasi del test della cometa
Incapsulamento cellulare
Innanzitutto, i ricercatori devono ottenere cellule da colture cellulari in vitro o da campioni in vivo, quindi disperdere queste cellule in singole cellule e sospenderle in agarosio a basso punto di fusione fuso a 37°C. Questa sospensione monocellulare viene poi distribuita su un vetrino da microscopio e, raffreddandosi, forma un sottile strato di agarosio. La pressione osmotica neutra dell'agarosio consente ai reagenti di penetrare senza influenzare la posizione delle cellule.
Screpolatura
Successivamente, i vetrini vengono immersi in una soluzione che provoca la lisi delle cellule. Questa soluzione contiene solitamente sale e detersivo altamente concentrati. L'acqua salata può distruggere la struttura proteica all'interno delle cellule e dissolvere la membrana cellulare. In questo modo, solo il DNA rimane intatto e riempie lo spazio precedentemente occupato dalla cellula, formando la cosiddetta struttura del cariotipo.
Elettroforesi
Una volta lisate le cellule, i vetrini vengono lavati per rimuovere i sali in eccesso e immersi nella soluzione di elettroforesi. Durante l'elettroforesi, il campo elettrico applicato fa sì che il DNA danneggiato si sposti verso l'anodo. In questo modo, il grado di danno influenza direttamente l'intervallo di migrazione del DNA e quindi la forma della "cometa".
Questa tecnologia ha una sensibilità estremamente elevata ai danni al DNA, il che la rende uno strumento di rilevamento molto diffuso.
Aree di applicazione
Il test della cometa è comunemente utilizzato nei campi dei test di genotossicità, del biomonitoraggio umano, dell'epidemiologia molecolare e della tossicologia ecogenetica. Studi recenti hanno dimostrato che durante l'invecchiamento è possibile rilevare diversi tipi di danni al DNA, come rotture a singolo filamento e rotture a doppio filamento, utilizzando il test della cometa. Nella diagnosi dell'infertilità maschile, i ricercatori possono anche utilizzare il test della cometa per valutare il grado di frammentazione del DNA negli spermatozoi.
Nel complesso, il test della cometa fornisce una tecnica efficace e flessibile per rilevare danni al DNA nelle cellule, che può svolgere un ruolo unico sia nella ricerca di base che nella scienza applicata. Con il continuo progresso di questa tecnologia, in futuro ci saranno modi più innovativi per rilevare e riparare i danni al DNA, consentendo alla salute umana di raggiungere nuovi traguardi?
