Language
Country/Area
No result found
I segreti del test della cometa: come rilevare danni al DNA con tecniche semplici?
Con il progresso della tecnologia genetica, lo studio dei danni al DNA è diventato sempre più importante. In questo settore, una tecnologia chiamata test dell’elettroforesi su gel unicellulare (noto anche come test della cometa) sta gradualmente guadagnando attenzione. Si tratta di una tecnica semplice e sensibile in grado di rilevare danni al DNA a livello delle singole cellule eucariotiche. Questa tecnica è stata sviluppata per la prima volta da Östling e Johansson nel 1984 e perfezionata nel 1988 da Singh et al. Ad oggi, è diventata una delle tecniche standard per la valutazione del danno/riparazione del DNA e per i test di genotossicità.
Il test della cometa prende il nome dal modello di migrazione del DNA nel gel per elettroforesi, che spesso ricorda una cometa.
La procedura di base del test della cometa prevede l'inclusione delle cellule in agarosio a basso punto di fusione, quindi la lisi delle cellule in condizioni neutre o alcaline e l'esecuzione dell'elettroforesi. Dopo l'elettroforesi, il DNA danneggiato assume forme diverse, con l'intensità relativa tra la coda e la testa della cometa che riflette l'entità del danno al DNA. La base di questa tecnica è che il DNA non danneggiato è altamente organizzato in associazione con le proteine della matrice nel nucleo della cellula e, quando il DNA è danneggiato, questa organizzazione viene interrotta, rilasciando strutture di DNA non danneggiate.
Passi base dell'esperimento sulla cometa
Celle incorporate
Innanzitutto, i campioni cellulari ottenuti da colture cellulari in vitro o soggetti di test in vivo vengono dispersi in cellule individuali e sospesi in agarosio a basso punto di fusione a 37°C. Questa singola sospensione viene quindi applicata su un vetrino da microscopio e, quando il vetrino coprioggetto viene abbassato, l'agarosio si espande e forma uno strato sottile. Quando l'agarosio viene congelato a 4°C, le cellule vengono immobilizzate al suo interno, formando una matrice di agarosio che stabilizza la posizione delle cellule.
Lisare le cellule
Successivamente, i vetrini vengono immersi in una soluzione di lisi, che solitamente contiene un'alta concentrazione di sali e detergenti solubili in acqua. Questi ingredienti distruggono le proteine all’interno delle cellule e lacerano le membrane cellulari, lasciando il DNA intatto. Le restanti strutture del DNA sono chiamate nuclidi e formano strutture relativamente grandi e ordinate.
Processo di elettroforesi
Dopo il processo di lisi, i vetrini vengono lavati per rimuovere tutti i sali e immersi nella soluzione elettroforetica. In questo momento, viene applicato un campo elettrico specifico e il DNA danneggiato verrà attratto dal campo elettrico. A seconda della lunghezza del segmento della catena, la distanza di migrazione sarà diversa, formando infine una coda e una struttura della testa simili a quelle di una cometa.
La tecnologia di analisi delle immagini quantifica l'intensità complessiva della fluorescenza dei nuclidi nonché la fluorescenza del DNA in migrazione, consentendo di valutare l'entità del danno al DNA.
Ambito di applicazione
Il test della cometa ha una vasta gamma di applicazioni, tra cui test di genotossicità, biomonitoraggio umano, epidemiologia molecolare e tossicologia genetica ecologica. Non solo può aiutare gli scienziati a comprendere l’impatto di diversi fattori ambientali sul DNA, ma anche ad approfondire la nostra comprensione del processo di invecchiamento monitorando i danni al DNA durante l’invecchiamento.
Ad esempio, Swain e Rao hanno riferito nel loro studio che il test della cometa ha mostrato un aumento significativo del danno al DNA nei neuroni cerebrali e negli astrociti nei ratti anziani.
Applicazione nell'infertilità maschile
Inoltre, il test della cometa ha anche un importante valore applicativo nella diagnosi dell’infertilità maschile. Questa tecnologia di test può aiutare a valutare il grado di frammentazione del DNA nello sperma e fornire previsioni sui possibili risultati durante la fecondazione in vitro.
Sfide sperimentali
Sebbene il test della cometa sia un metodo molto sensibile per rilevare danni al DNA, la sua sensibilità lo rende anche particolarmente sensibile ad alcuni cambiamenti fisici che possono influenzare la riproducibilità dei risultati. Pertanto, è necessario prestare particolare attenzione durante l'esecuzione della procedura per evitare eventuali fattori interferenti che potrebbero causare danni al DNA.
Essendo una tecnologia semplice ed economicamente vantaggiosa, il test della cometa viene spesso utilizzato in ambienti di ricerca con condizioni complesse e risorse finanziarie limitate. Con l’emergere di ulteriori ricerche e strumenti migliorati, le prospettive applicative di questa tecnologia sono promettenti. Riuscirà a superare ulteriori ostacoli scientifici e a scoprire nuovi modi di riparazione del DNA in futuro?
