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Il fascino misterioso della microscopia FLIM: come utilizzare la durata della fluorescenza per rilevare i segreti del microambiente?
Nella ricerca scientifica, la comprensione dell'ambiente microscopico è fondamentale, soprattutto nei campi della biologia e della chimica. La microscopia a fluorescenza a immagini a vita intera (FLIM) è una tecnica potente che può sondare in profondità i segreti del microambiente e aprirci una finestra completamente nuova. In questo articolo analizzeremo il funzionamento del FLIM e il modo in cui può fornire spunti preziosi nella ricerca.
Principi fondamentali del FLIM
FLIM si basa fondamentalmente sulla durata di vita delle molecole fluorescenti piuttosto che sulla loro intensità di emissione per generare immagini. In altre parole, FLIM è in grado di misurare la durata di vita delle molecole fluorescenti, che è strettamente correlata alle caratteristiche del microambiente locale. Pertanto, FLIM può eliminare efficacemente gli errori causati da variazioni nella luminosità della sorgente luminosa, nell'intensità della luce di fondo o da un limitato fotosbiancamento.
La durata della fluorescenza dipende dalle proprietà del microambiente e può quindi fornire indicazioni su pH, viscosità e concentrazione chimica.
Durata della fluorescenza
Quando una molecola fluorescente viene eccitata da un fotone, tornerà allo stato fondamentale attraverso molteplici percorsi di decadimento con una certa probabilità, almeno uno dei quali è l'emissione di fotoni tramite radiazione spontanea. In FLIM, il processo di decadimento della fluorescenza segue il decadimento esponenziale che può essere descritto come:
I(t) = I0 * e^(-t/τ)
Dove τ rappresenta la durata della fluorescenza. Il punto chiave qui è che questa misurazione della durata è indipendente dall'intensità iniziale della fluorescenza, consentendo quindi misurazioni senza riferimento all'intensità nella rilevazione chimica.
Tecnologia di misurazione
Durante l'imaging FLIM, l'intensità di ciascun pixel nell'immagine è determinata dalla durata della fluorescenza, il che ci consente di osservare contrasti tra materiali con diversi tassi di decadimento anche alla stessa lunghezza d'onda e di osservare ulteriormente i cambiamenti nel percorso di attenuazione FRET nell'imaging.
Metodo di eccitazione a impulsi
Il metodo di eccitazione a impulsi è ampiamente utilizzato nella tecnologia FLIM. Dopo aver eccitato le molecole fluorescenti con impulsi laser ultrabrevi, la fluorescenza risolta nel tempo mostra un decadimento esponenziale. Tuttavia, a causa dell'esistenza della funzione di risposta dello strumento, il segnale di fluorescenza effettivamente misurato non sarà un decadimento esponenziale puro. Per risolvere questo problema, spesso si ricorre alla tecnologia del conteggio dei singoli fotoni correlato nel tempo (TCSPC), che riesce a compensare le variazioni nell'intensità della sorgente luminosa e nell'ampiezza dell'impulso del singolo fotone.
Utilizzando un dispositivo TCSPC commerciale, è possibile registrare le curve di decadimento della fluorescenza con una risoluzione temporale fino a 405 fs.
Metodo di modulazione di fase
Un'altra tecnica è la modulazione di fase. Questo metodo utilizza una sorgente laser ad alta frequenza e il cambiamento di fase del suo segnale di fluorescenza è direttamente correlato alla durata di vita delle molecole fluorescenti, il che consente una maggiore velocità di imaging nella ricerca sulle cellule viventi.
Metodi di analisi
I dati generati da FLIM devono essere analizzati mediante algoritmi appropriati per estrarre la curva di decadimento puro e stimare la durata di vita. Le tecniche comunemente utilizzate includono il metodo dei minimi quadrati e la riconvoluzione iterativa. Come abbinare in modo efficace la misurazione effettiva al modello previsto è una delle sfide nell'elaborazione dei dati FLIM.
L'obiettivo principale di questa tecnica è quello di estrarre la curva di decadimento puro minimizzando la somma ponderata dei residui.
Prospettive future
La tecnologia FLIM viene sempre più utilizzata con l'avvento di nuovi strumenti di imaging, soprattutto nell'osservazione in tempo reale dei cambiamenti all'interno delle cellule viventi e del loro microambiente. Il desiderio della comunità scientifica di comprendere più a fondo i cambiamenti chimici all'interno delle cellule continua a spingere il progresso di questa tecnologia.
Con lo sviluppo della tecnologia FLIM, molti misteri irrisolti saranno esplorati. In che modo la ricerca futura rivelerà ulteriormente i misteri del microambiente?
