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Gli straordinari utilizzi della microscopia FLIM: come ottenere immagini ad altissima risoluzione con rilevamento in tempo reale?
Poiché la scienza e la tecnologia progrediscono rapidamente, anche la tecnologia dei microscopi è in continua innovazione. Tra queste, la microscopia a fluorescenza a immagini a durata di vita (FLIM) è diventata uno strumento importante nella ricerca sulle scienze della vita e sui materiali grazie al suo principio di imaging unico e alle sue applicazioni pratiche. A differenza della microscopia tradizionale, che utilizza l'intensità della fluorescenza come base per l'imaging, la tecnologia FLIM genera immagini in base alla velocità con cui le molecole fluorescenti ritornano da uno stato eccitato a uno stato fondamentale, anziché in base alla loro intensità.
Misurando la durata della fluorescenza, FLIM non solo elimina gli errori di misurazione causati da variazioni nella luminosità della sorgente luminosa, nell'intensità della luce di fondo o nel fotodecoloramento, ma riduce anche al minimo gli effetti della diffusione dei fotoni in strati spessi di campioni.
"La variazione della durata della fluorescenza dipende dal microambiente locale della molecola fluorescente e può quindi fungere da indicatore del pH, della viscosità e della concentrazione chimica, tra le altre cose."
Principi fondamentali della durata della fluorescenza
Quando vengono eccitate dai fotoni, le molecole dei fotoni ritornano allo stato fondamentale con diverse probabilità attraverso radiazioni elettromagnetiche e percorsi di decadimento non radiativo. Soltanto il percorso che prevede l'emissione spontanea di fotoni porta alla formazione della fluorescenza. Secondo la legge di Schott, l'espressione matematica del decadimento dell'intensità della fluorescenza nel tempo può essere semplificata in una funzione esponenziale. Ciò dimostra che la durata della fluorescenza è una grandezza fisica indipendente dall'intensità iniziale.
Tecnologia di misurazione e implementazione FLIM
Nel FLIM, lo strumento utilizza una sorgente di eccitazione pulsata e poi registra la curva di decadimento tramite la funzione di risposta della macchina. Quando un gruppo di molecole fluorescenti viene eccitato da un impulso luminoso ultrabreve, la fluorescenza risolta nel tempo risultante presenterà inevitabilmente un decadimento esponenziale. L'implementazione più comune si basa sul conteggio di singoli fotoni correlato nel tempo (TCSPC), una tecnica che migliora la precisione della misurazione e riduce al minimo l'impatto del rumore di fondo.
"Utilizzando l'apparecchiatura TCSPC commerciale, la risoluzione temporale della curva di decadimento della fluorescenza può raggiungere i 405 femtosecondi."
Ambito di applicazione
La tecnologia FLIM offre vantaggi unici nello studio delle cellule viventi e del loro microambiente. Questa tecnologia è in grado di distinguere diversi movimenti molecolari su scala nanometrica e può essere utilizzata per studiare le interazioni biomolecolari, i cambiamenti nell'attività enzimatica intracellulare, ecc.
Negli ultimi anni, la tecnologia FLIM è stata ulteriormente applicata alla diagnosi medica, in particolare nella chirurgia dei tumori cerebrali, dove può essere combinata con gli endoscopi per implementare la diagnosi in tempo reale. Misurando la durata della fluorescenza del tessuto tumorale, i medici possono valutare con maggiore accuratezza i confini e le proprietà del tumore.
Analisi dei dati e prospettive future
Nell'analisi delle immagini FLIM, l'estrazione delle curve di decadimento puro e la stima della durata della fluorescenza sono attività fondamentali. A questo proposito, sono stati proposti diversi algoritmi, che si tratti del metodo dei minimi quadrati o del metodo di determinazione rapida della vita, che migliorano costantemente l'accuratezza e la praticità del calcolo.
"Lo sviluppo di questi metodi ha trasformato FLIM da una teoria di laboratorio in un metodo più pratico e conveniente, consentendo a questa tecnologia di entrare in clinica."
Con il progresso della tecnologia, la velocità di acquisizione delle immagini FLIM continuerà ad aumentare e il campo di applicazione diventerà più ampio. Che si tratti di ricerca scientifica di base o di diagnosi clinica, il potenziale di questa tecnologia non può essere ignorato. Tuttavia, con l'ampliamento dei suoi campi di applicazione, dobbiamo riflettere su come combinare al meglio la tecnologia FLIM con altre tecniche per promuovere lo sviluppo e l'innovazione della biomedicina.
