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I segreti della reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa: come rivelare l'espressione genica attraverso l'RNA?
La reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa (RT-PCR) è una tecnica di laboratorio che combina la trascrizione dell'RNA in DNA (in questo contesto chiamato DNA complementare o cDNA) e l'amplificazione di uno specifico bersaglio del DNA. Questo processo utilizza la catena della polimerasi reazione (PCR). Questa tecnica viene utilizzata principalmente per misurare la quantità di RNA specifico monitorando la fluorescenza della reazione di amplificazione, chiamata PCR in tempo reale o PCR quantitativa (qPCR). Nella letteratura scientifica, il termine RT-PCR viene talvolta utilizzato in modo fuorviante da alcuni autori per riferirsi alla PCR in tempo reale. In questo articolo ci riferiamo specificatamente alla RT-PCR come PCR a trascrizione inversa.
Grazie alla sua semplicità, elevata specificità e sensibilità, la RT-PCR è stata utilizzata in un'ampia gamma di esperimenti, dalla quantificazione delle cellule di lievito nel vino al rilevamento di agenti patogeni infettivi.
Principi e applicazioni della RT-PCR
Il principio della RT-PCR è quello di convertire innanzitutto lo stampo di RNA in cDNA, che viene poi amplificato esponenzialmente mediante PCR. Questa rivoluzionaria modifica nel processo ci consente di rilevare le trascrizioni di quasi tutti i geni e di amplificare i campioni, eliminando le grandi quantità di materiale di partenza richieste quando si utilizza il Northern blotting.
La RT-PCR è diventata una delle tecniche più importanti, dall'analisi dell'espressione genica alla diagnosi di agenti patogeni infettivi. Ad esempio, gli scienziati stanno studiando come utilizzare la RT-PCR nei test sul cancro per migliorare la prognosi e monitorare la risposta al trattamento.
Ad esempio, le cellule tumorali circolanti producono trascrizioni di mRNA uniche a seconda del tipo di cancro e la RT-PCR può analizzare i livelli di espressione di queste trascrizioni.
Evoluzione tecnica della RT-PCR
Sin dalla prima introduzione del Northern blotting nel 1977, sebbene la tecnica presenti degli svantaggi nella quantificazione dell'RNA, come il fatto di richiedere molto tempo e grandi quantità di RNA, la RT-PCR è diventata un metodo popolare per il rilevamento e la quantificazione dell'RNA sin dall'invenzione di PCR di Kary Mullis nel 1983. Il metodo di scelta per la quantificazione. Questo processo non solo non richiede alcuna post-elaborazione, ma può anche misurare l'abbondanza di RNA più di 107 volte, fornendo ulteriormente dati qualitativi e quantitativi.Attualmente la tecnologia RT-PCR ha sviluppato diverse modalità operative: one-stop e two-step. La RT-PCR in due fasi richiede che la trascrizione inversa e l'amplificazione PCR vengano eseguite in provette diverse, mentre la RT-PCR one-stop può essere completata in una sola provetta. Sebbene il metodo one-stop sia più comodo per una rilevazione rapida, è soggetto al degrado del campione quando vengono eseguiti test ripetuti.
Sfide e direzioni future della RT-PCR
Sebbene la tecnologia RT-PCR presenti numerosi vantaggi, presenta ancora alcune sfide. Ad esempio, durante più cicli di PCR, la crescita esponenziale del DNA complementare (cDNA) dopo la trascrizione inversa produce una quantificazione imprecisa del punto finale, mentre la qRT-PCR supera questo problema grazie all'aggiunta della tecnologia di monitoraggio della fluorescenza. Inoltre, l'elevata sensibilità fa sì che anche tracce di contaminazione da DNA possano alterare i risultati. Pertanto è fondamentale pianificare e progettare tenendo conto delle fonti di variazione nella tecnologia.
Ad esempio, l'aggiunta di una quantità nota di RNA come campione di riferimento può aiutare i ricercatori a eseguire analisi e controlli quantitativi.
Grazie alla continua evoluzione della tecnologia, la RT-PCR ha un ampio potenziale applicativo nella diagnosi genetica, nella rilevazione del cancro e nello screening precoce delle malattie. Si può prevedere che nella futura ricerca scientifica questa tecnologia avrà un ruolo sempre più importante nella comprensione dei cambiamenti nell'espressione genica e dei meccanismi che li determinano.
Con lo studio approfondito della tecnologia RT-PCR, in che modo l'applicazione di questa tecnologia nella biologia genetica cambierà ulteriormente la nostra comprensione dei processi vitali?
