Achim Magener

Expression of cytokeratin 20 in thyroid carcinomas and peripheral blood detected by reverse transcription polymerase chain reaction

We investigated a nested reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) system to detect CK20 mRNA in thyroid carcinomas, benign thyroid diseases and peripheral blood to improve diagnosis of thyroid carcinoma and to detect disseminated tumour cells. Frozen tissue samples of 46 thyroid carcinomas and 30 benign thyroid diseases (14 multinodular goiters, 14 follicular adenomas, two Hashimoto’s hyroiditis) were obtained intraoperatively. Preoperative blood samples were drawn from 31 patients with thyroid cancer, nine patients with benign thyroid disorders and 20 healthy volunteers. Nine out of nine medullary, 9/12 follicular, 7/19 papillary and 2/6 anaplastic carcinomas expressed CK20 transcripts. CK20 mRNA was undetectable in 30 tissue sections of benign thyroid diseases. Circulating tumour cells were found in the blood of 3/8 patients with medullary carcinoma, 2/8 patients with follicular carcinoma, 2/11 patients with papillary carcinoma and 1/4 patients with an anaplastic carcinoma. Nine blood samples of patients with benign thyroid diseases and 20 healthy volunteers tested negative. For the first time CK20 mRNA could be detected in tissue sections of thyroid carcinomas and peripheral blood samples of patients with thyroid cancer. It was not detectable in benign thyroid diseases. Our results therefore strongly suggest that CK20 RT-PCR assays may improve the diagnosis of thyroid carcinoma and is able to detect circulating tumour cells in peripheral blood of thyroid carcinoma patients.

Konventionelle und molekularpathologische Untersuchungen während und nach klinischer Herztransplantation

ZusammenfassungDie wesentlichen Fragen nach Herztransplantation (HTx) beinhalten Transplantatversagen, akute Abstoßung, Infektionen und die chronische Rejektion. Im Rahmen der HTx wurden rechtsventrikuläre Myokardbiopsien zu folgenden Zeitpunkten entnommen: a) vor Kardioplegie, b) sofort nach Kardioplegie mit Custodiol® und Explantation, c) vor Implantation, d) nach 30 und/oder 60 min Reperfusion, e) im ersten postoperativen Monat wöchentlich und danach in größeren Intervallen. Nach Formalinfixierung der Proben und Schnelleinbettung in Paraffin erfolgten histopathologische Begutachtung und immunhistochemische Analysen. Nach Fixierung mit gepuffertem Glutar- und Paraformaldehyd wurde der ultrastrukturelle Erhaltungsgrad des Myokards beurteilt. Schockgefrorene Proben wurden für immunhistochemische und molekularpathologische Untersuchungen herangezogen. Mittels konventioneller Licht- und Elektronenmikroskopie wurden Veränderungen der Zusammensetzung des Myokards (interstitielle Infiltrate, Fibrose), der Kardiomyozyten (Zellödem, Hypertrophie) und Endothelien (Organellenschäden, Zellödem) qualitativ und morphometrisch charakterisiert. Molekulare Veränderungen im Rahmen entzündlicher Prozesse (akuter myozytärer und/oder vaskulärer Rejektionen, Infektionen) oder komplexer Vorgänge wie der chronischen Rejektion wurden mittels Immunhistochemie auf Protein-Ebene und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder In situ-Hybridisierung auf DNA- oder mRNA-Ebene analysiert.Qualitativ und morphometrisch waren lichtmikroskopisch nach vier Stunden Ischämie keine Unterschiede zwischen den nach Ex- und Implantation entnommenen Proben auszumachen. Elektronenmikroskopisch zeigten die Kapillarendothelien eine wesentlich höhere Empfindlichkeit gegenüber Ischämie/Reperfusion als die Kardiomyozyten. Bestimmte quantitative ultrastrukturelle Parameter der Strukturprotektion zeigten statistisch signifikante Korrelationen mit der Ischämiezeit, andere mit der Anzahl und dem Schweregrad der myozytären oder vaskulären Rejektionen im ersten Jahr nach HTx. Infektionen mit dem Zytomegalie-Virus wurden mittels Immunhistochemie und In situ-PCR nachgewiesen, veränderte Expressionen von Zytokinen und Wachstumsfaktoren mittels immunhistochemie und In situ-Hybridisierung. Nur durch einen differenzierten Einsatz konventioneller und molekularer Methoden können unterschiedliche Fragen nach HTx beantwortet werden. Voraussetzung dafür ist eine adäquate Entnahme, Fixierung und Aufarbeitung der jeweiligen Proben.SummaryThe most important diagnostic questions following HTx relate to graft failure, acute rejection, infections and chronic rejection. Right ventricular biopsies were taken during and following HTx at different time points: a) before cardioplegia, b) immediately following cardioplegia with Custodiol® and explantation, c) before implantation, d) after 30 and/or 60 min reperfusion, e) weekly during the first postoperative month and then after longer time intervals. After fixation of the probes in formalin and rapid embedding in paraffin, histopathology of the myocardium was evaluated, immunocytochemical analyses followed. Applying fixation in buffered glutar- and paraformaldehyde and embedding in epon-araldite, myocardial ultrastructural preservation was evaluated. Samples rapidly frozen in liquid nitrogen were taken for immunocytochemical and/or molecular investigations. By means of conventional light and electron microscopy, alterations of the composition of the myocardium (interstitial infiltrates, fibrosis), of cardiac myocytes (cellular edema, hypertrophy), and of endothelia (damage of cell organelles, cellular edema) were evaluated qualitatively and morphometrically. Molecular alterations underlying inflammation (acute myocardial and/or vascular rejections, infections) or complex processes such as chronic rejection were investigated on the protein level by means of immunocytochemistry and on the DNA or mRNA level by means of the polymerase chain reaction (PCR) or in situ hybridization.Qualitatively and morphometrically, light microscopy could not detect differences between biopsies taken after explantation and those before implantation following 4 hours of ischemia. Ultrastructural stereology was able to demonstrate that during HTx capillary endothelia were more susceptible to ischemia/reperfusion than cardiac myocytes. Single quantitative ultra-structural parameters for structural protection showed statistically significant correlations with the duration of ischemia. Different parameters correlated with the number and severity of myocardial or vascular rejections during the first year after HTx. Infections with the cytomegalovirus were detected by means of immunocytochemistry and in situ PCR. Altered expression of cytokines and growth factors was demonstrated by means of immunocytochemistry and in situ hybridization.Thus, different questions following HTx can only be answered by application of corresponding conventional and/or molecular methods, provided that adaequately fixed samples are prepared.

Discordant atrioventricular and ventriculoarterial connections with partially unguarded left-sided atrioventricular orifice and aortic atresia

Congenitally unguarded morphologically tricuspid valvar orifice is a rare abnormality, usually associated with pulmonary atresia. We describe such a case found in association with discordant atrioventricular and ventriculoarterial connections in which the aortic valve was atretic. Presentation was with respiratory distress due to severe cardiac failure after birth. Echocardiography demonstrated a dilated systemic ventricle with poor function, left atrial enlargement, and aortic atresia. The clinical findings were confirmed at autopsy.

DNA-Zytometrie beim Mammakarzinom Übersicht zur Methode und zum Stellenwert bei der Prognoseabschätzung

ZusammenfassungDie DNA-Zytometrie hat sich zu einer diagnostischen Routinetechnik entwickelt, die bevorzugt beim Mammakarzinom zur Beurteilung der Ploidie und der Proliferationskinetik (Zellzyklusanalyse) eingesetzt wird. Dabei ist die statische Zytometrie (Mikroskopzytometrie) aus Gründen der geringeren Aussagekraft der Durchflußzytometrie unterlegen. Die Durchflußzytometrie erfordert zur S-Phasen-Bestimmung eine standardisierte und methodisch einwandfreie Technik mit einem niedrigen Variationskoeffizienten (CV). Die gewonnenen Parameter, in 1. Linie die S-Phase und der Proliferationsindex, in 2. Linie auch die Ploidie, stellen prognostisch und für die Therapieplanung wichtige Faktoren dar. Eine genaue Kenntnis der Methode und der Fehlermöglichkeiten ist für die Interpretation der Ergebnisse unerläßlich. Inwieweit immunhistologische Techniken zur Bestimmung der Proliferationskinetik gleichwertige Informationen liefern, muß zum gegenwärtigen Zeitpunkt als ungeklärt angesehen werden. Weitere Entwicklungen betreffen die Einführung von multiparametrischen Untersuchungen und Verbesserung der mathematischen Analyse der Meßwerte.SummaryDNA flow cytometry (FCM) has become a routine method in breast cancer diagnosis for evaluation of ploidy and proliferation kinetics (cell cycle analysis). Image cytometry is less practicable and provides less information than flow cytometry. An optimized technique with a low coefficient of variation is required for optimal results in flow cytometry. The S-phase fraction and the proliferation index (sum of S-phase fraction and G2M fraction) provide prognostic and therapeutically relevant information. A profound knowledge of the technique and its limitations is indispensable for the interpretation of FCM results. It remains to be established whether immunohistological evaluation of cell proliferation has the same prognostic value. Future developments are to be expected from multiparametric analysis and the improvement of mathematical analysis of FCM measurements.