Aleksandar Radonić

Gene expression studies in prostate cancer tissue: which reference gene should be selected for normalization?

Using quantitative reverse transcription–polymerase chain reaction (RT-PCR), reference genes are utilized as endogenous controls for relative quantification of target genes in gene profiling studies. The suitability of housekeeping genes for that purpose in prostate cancer tissue has not been sufficiently investigated so far. The objective of this study was to select from a panel of 16 potential candidate reference genes the most stable genes for gene normalization. Expression of mRNA encoding ACTB, ALAS1, ALB, B2M, G6PD, GAPD, HMBS, HPRT1, K-ALPHA-1, POLR2A, PPIA, RPL13A, SDHA, TBP, UBC, and YWHAZ was examined in matched, microdissected malignant and nonmalignant tissue specimens obtained from 17 nontreated prostate carcinomas after radical prostatectomy by real-time RT-PCR. The genes studied displayed a wide expression range with cycle threshold values between 16 and 37. The expression was not different between samples from pT2 and pT3 tumors or between samples with Gleason scores <7 and ≥7 (P>0.05). ACTB, RPL13A, and HMBS showed significant differences (P<0.02 at least) in expressions between malignant and nonmalignant pairs. All other genes did not differ between the matched pairs, and the software programs geNorm and NormFinder were used to ascertain the most suitable reference genes from these candidates. HPRT1, ALAS1, and K-ALPHA-1 were calculated by both programs to be the most stable genes covering a broad range of expression. The expression of the target gene RECK normalized with HRPT1 alone and with the normalization factors generated by the combination of these three reference genes as well as with the unstable genes ACTB or RPL13A is given. That example shows the significance of using suitable reference genes to avoid erroneous normalizations in gene profiling studies for prostate cancer. The use of HPRT1 alone as a reference gene shown in our study was sufficient, but the normalization factors generated from two (HRPT1, ALAS1) or all three genes (HRPT1, ALAS1, K-ALPHA-1) should be considered for an improved reliability of normalization in gene profiling studies of prostate cancer.

Reference gene selection for quantitative real-time PCR analysis in virus infected cells: SARS corona virus, Yellow fever virus, Human Herpesvirus-6, Camelpox virus and Cytomegalovirus infections

Ten potential reference genes were compared for their use in experiments investigating cellular mRNA expression of virus infected cells. Human cell lines were infected with Cytomegalovirus, Human Herpesvirus-6, Camelpox virus, SARS coronavirus or Yellow fever virus. The expression levels of these genes and the viral replication were determined by real-time PCR. Genes were ranked by the BestKeeper tool, the GeNorm tool and by criteria we reported previously. Ranking lists of the genes tested were tool dependent. However, over all, β-actin is an unsuitable as reference gene, whereas TATA-Box binding protein and peptidyl-prolyl-isomerase A are stable reference genes for expression studies in virus infected cells.

Identification and Validation of Suitable Endogenous Reference Genes for Gene Expression Studies of Human Bladder Cancer

PURPOSEnHousekeeping genes as endogenous references are generally used for the relative quantification of target genes in gene profiling studies. To date that issue has not been sufficiently investigated in bladder cancer. From a panel of 9 potential candidates we selected the most stable housekeeping genes for gene normalization in bladder cancer tissue.nnnMATERIALS AND METHODSnExpression profiles of the 9 genes ACTB, ALAS1, G6PD, GAPD, HMBS, HPRT1, K-ALPHA-1, SDHA and TBP were established in matched malignant and nonmalignant tissue specimens from 14 patients with bladder cancer. Quality assessment of isolated RNA was performed with a 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, California) and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction was performed with LightCycler. The software geNorm and NormFinder (Aarhus University, Aarhus, Denmark) were used to identify the most suitable reference genes.nnnRESULTSnRNA was isolated with high purity and integrity. Candidate reference genes showed a broad range of between 20 and 34 polymerase chain reaction cycles. Expression did not depend on patient sex or tumor stage. GAPD, G6PD and HMBS showed significant differences in expression between malignant and nonmalignant pairs (at least p <0.04). Expression of the remaining genes did not differ between the matched pairs. SDHA and TBP were the most stably expressed genes, covering higher and lower expression levels.nnnCONCLUSIONSnFor normalization purposes in gene profiling studies of bladder cancer the genes SDH and TBP are recommended as single reference genes depending on the expression level of the target gene or more favorably in combination.

Infections with human herpesvirus 6 variant B delay platelet engraftment after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation

The clinical significance of human herpesvirus (HHV‐6) infections after allogeneic stem cell transplantation (SCT) remains controversial. We analysed cryoconserved plasma samples from 82 patients after allogeneic SCT by quantitative polymerase chain reaction for HHV‐6 variants A and B. Platelet engraftment was delayed in patients with HHV‐6B infections but not with HHV‐6A infections detected before day +28. In multivariate analysis early HHV‐6B infections and the type of conditioning were associated with platelet engraftment. In conclusion, the two variants of HHV‐6 should be studied separately; early infections with HHV‐6B may contribute to delayed platelet engraftment after allogeneic SCT.

Quantitative expression analysis of HHV-6 cell receptor CD46 on cells of human cord blood, peripheral blood and G-CSF mobilised leukapheresis cells

Human herpesvirus-6 (HHV-6) can infect blood cells and thereby may inhibit hematopoietic stem and progenitor cell expansion and differentiation. In this context, it has been discussed if early progenitor cells can be infected by HHV-6. CD46 was identified as one possible cellular surface receptor for HHV-6. The study presented here had been done to get insight into the susceptibility of various leukocyte subpopulations to HHV-6 (including early hematopoietic progenitors) by determining the amount of CD46 molecules expressed on their surfaces. Human cord blood cells, peripheral blood cells and G-CSF mobilised progenitor cells were analysed by flow cytometry. CD46 molecule number per cell was determined and compared to calibration beads conjugated with known ratio of PE per bead. Highest CD46 expression was detected on B- lymphocytes, whereas T-lymphocytes only showed about half of the amount found on B cells. Hematopoietic progenitors also carried CD46 at intermediate levels. Unexpectedly, CD46 expression on progenitors from G-CSF mobilised leukapheresis products was approximately 20% of that found on comparable cells from untreated cord blood. In conclusion, hematopoietic progenitor cells express CD46 on their surface, thereby fulfilling a basic requirement for the susceptibility of HHV-6 infection.

Quantifying gene expression in prostate carcinoma. Which endogenous reference genes are suitable

kologie die Grundlage für die Entwicklung neuer Biomarker und die Erfassung potenzieller Zielstrukturen von Medikamenten. Diese Studien basieren auf quantitativen Daten spezifischer mRNA, die mit Hilfe der Real-time-RT-PCR (reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion) bestimmt werden. Für die Auswertung der Expressionsdaten ist die relative Quantifizierung die am häufigsten benutzte Methode. Hierbei wird die Höhe der Expression eines Zielgens auf ein endogenes, ein sog. „Housekeeping-Gen“ oder Referenzgen bzw. auf einen sich aus mehreren Referenzgenen zusammengesetzten Normierungsfaktor bezogen [5]. Vorteile einer relativen im Vergleich zur absoluten Quantifizierung sind, dass Effekte, die bei der Probenmaterialgewinnung, RNA-Isolierung oder reversen Transkription auftreten können, über die Bestimmung des Zielund Referenzgens aus der gleichen cDNA-Probe weitgehend ausgeglichen werden können. Um Fehler bei der Interpretation von Expressionsdaten zu vermeiden, müssen Referenzgene jedoch folgende Anforderungen erfüllen: ubiquitäres Vorkommen, konstante nicht-regulierte Expression im Untersuchungsmaterial (z. B. Gewebe, Zellen), ein Expressionsniveau ähnlich dem des Zielgens und Pseudogenfreiheit. Eine Medline-Recherche ergab, dass ausreichend fundierte Untersuchungen über geeignete Referenzgene beim Prostatakarzinom fehlen [4]. In >60% der Studien wird noch immer mit Hilfe der Gene β-Actin oder GAPD eine relative Quantifizierung vorgenommen, obwohl zahlreiche Untersuchungen deren Eignung in Frage stellen. Auf der Basis dieser Literaturrecherche untersuchten wir ein Panel von 16 möglichen Kandidatengenen (ACTB β-Actin, ALAS1 δAminolävulinatsynthase, ALB Albumin, β2M β2-Microglobulin, G6PD Glucose6-Phosphatdehydrogenase, GAPD Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, HMBS Hydroxymethylbilansynthase, HPRT1 Hypoxanthinphosphoribosyltransferase 1, K-ALPHA-1 K-ALPHA1-Tubulin, POLR2A RNA-Polymerase II, PPIA Peptidylprolylisomerase A, RPL13A ribosomales Protein L13a, SDHA Succinatdehydrogenase-Komplex, Untereinheit A, TBP TATA-Box-bindendes Protein, UBC Ubiquitin C, YWHAZ Tyrosin-3-Monooxygenase), [4]. Genexpressionen dieser Kandidatengene wurden in gepaarten malignen und nicht-malignen Prostatagewebeproben nach Mikrodissektion von 17 Prostatektomiepräparaten bestimmt. Die Expressionshöhen der 16 untersuchten Kandidatengene zeigten einen weiten Bereich, der etwa von 16–37 PCRZyklen reichte (. Abb. 1). Die Gene HMBS (p=0,009), ACTB (p=0,010) und RPL13A (p=0,013) wiesen signifikant unterschiedliche Expressionen zwischen den

Quantifizierung von Genexpressionen beim Prostatakarzinom

kologie die Grundlage für die Entwicklung neuer Biomarker und die Erfassung potenzieller Zielstrukturen von Medikamenten. Diese Studien basieren auf quantitativen Daten spezifischer mRNA, die mit Hilfe der Real-time-RT-PCR (reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion) bestimmt werden. Für die Auswertung der Expressionsdaten ist die relative Quantifizierung die am häufigsten benutzte Methode. Hierbei wird die Höhe der Expression eines Zielgens auf ein endogenes, ein sog. „Housekeeping-Gen“ oder Referenzgen bzw. auf einen sich aus mehreren Referenzgenen zusammengesetzten Normierungsfaktor bezogen [5]. Vorteile einer relativen im Vergleich zur absoluten Quantifizierung sind, dass Effekte, die bei der Probenmaterialgewinnung, RNA-Isolierung oder reversen Transkription auftreten können, über die Bestimmung des Zielund Referenzgens aus der gleichen cDNA-Probe weitgehend ausgeglichen werden können. Um Fehler bei der Interpretation von Expressionsdaten zu vermeiden, müssen Referenzgene jedoch folgende Anforderungen erfüllen: ubiquitäres Vorkommen, konstante nicht-regulierte Expression im Untersuchungsmaterial (z. B. Gewebe, Zellen), ein Expressionsniveau ähnlich dem des Zielgens und Pseudogenfreiheit. Eine Medline-Recherche ergab, dass ausreichend fundierte Untersuchungen über geeignete Referenzgene beim Prostatakarzinom fehlen [4]. In >60% der Studien wird noch immer mit Hilfe der Gene β-Actin oder GAPD eine relative Quantifizierung vorgenommen, obwohl zahlreiche Untersuchungen deren Eignung in Frage stellen. Auf der Basis dieser Literaturrecherche untersuchten wir ein Panel von 16 möglichen Kandidatengenen (ACTB β-Actin, ALAS1 δAminolävulinatsynthase, ALB Albumin, β2M β2-Microglobulin, G6PD Glucose6-Phosphatdehydrogenase, GAPD Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, HMBS Hydroxymethylbilansynthase, HPRT1 Hypoxanthinphosphoribosyltransferase 1, K-ALPHA-1 K-ALPHA1-Tubulin, POLR2A RNA-Polymerase II, PPIA Peptidylprolylisomerase A, RPL13A ribosomales Protein L13a, SDHA Succinatdehydrogenase-Komplex, Untereinheit A, TBP TATA-Box-bindendes Protein, UBC Ubiquitin C, YWHAZ Tyrosin-3-Monooxygenase), [4]. Genexpressionen dieser Kandidatengene wurden in gepaarten malignen und nicht-malignen Prostatagewebeproben nach Mikrodissektion von 17 Prostatektomiepräparaten bestimmt. Die Expressionshöhen der 16 untersuchten Kandidatengene zeigten einen weiten Bereich, der etwa von 16–37 PCRZyklen reichte (. Abb. 1). Die Gene HMBS (p=0,009), ACTB (p=0,010) und RPL13A (p=0,013) wiesen signifikant unterschiedliche Expressionen zwischen den

Quantifizierung von Genexpressionen beim Prostatakarzinom: Welche endogenen Referenzgene sind geeignet?

kologie die Grundlage für die Entwicklung neuer Biomarker und die Erfassung potenzieller Zielstrukturen von Medikamenten. Diese Studien basieren auf quantitativen Daten spezifischer mRNA, die mit Hilfe der Real-time-RT-PCR (reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion) bestimmt werden. Für die Auswertung der Expressionsdaten ist die relative Quantifizierung die am häufigsten benutzte Methode. Hierbei wird die Höhe der Expression eines Zielgens auf ein endogenes, ein sog. „Housekeeping-Gen“ oder Referenzgen bzw. auf einen sich aus mehreren Referenzgenen zusammengesetzten Normierungsfaktor bezogen [5]. Vorteile einer relativen im Vergleich zur absoluten Quantifizierung sind, dass Effekte, die bei der Probenmaterialgewinnung, RNA-Isolierung oder reversen Transkription auftreten können, über die Bestimmung des Zielund Referenzgens aus der gleichen cDNA-Probe weitgehend ausgeglichen werden können. Um Fehler bei der Interpretation von Expressionsdaten zu vermeiden, müssen Referenzgene jedoch folgende Anforderungen erfüllen: ubiquitäres Vorkommen, konstante nicht-regulierte Expression im Untersuchungsmaterial (z. B. Gewebe, Zellen), ein Expressionsniveau ähnlich dem des Zielgens und Pseudogenfreiheit. Eine Medline-Recherche ergab, dass ausreichend fundierte Untersuchungen über geeignete Referenzgene beim Prostatakarzinom fehlen [4]. In >60% der Studien wird noch immer mit Hilfe der Gene β-Actin oder GAPD eine relative Quantifizierung vorgenommen, obwohl zahlreiche Untersuchungen deren Eignung in Frage stellen. Auf der Basis dieser Literaturrecherche untersuchten wir ein Panel von 16 möglichen Kandidatengenen (ACTB β-Actin, ALAS1 δAminolävulinatsynthase, ALB Albumin, β2M β2-Microglobulin, G6PD Glucose6-Phosphatdehydrogenase, GAPD Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, HMBS Hydroxymethylbilansynthase, HPRT1 Hypoxanthinphosphoribosyltransferase 1, K-ALPHA-1 K-ALPHA1-Tubulin, POLR2A RNA-Polymerase II, PPIA Peptidylprolylisomerase A, RPL13A ribosomales Protein L13a, SDHA Succinatdehydrogenase-Komplex, Untereinheit A, TBP TATA-Box-bindendes Protein, UBC Ubiquitin C, YWHAZ Tyrosin-3-Monooxygenase), [4]. Genexpressionen dieser Kandidatengene wurden in gepaarten malignen und nicht-malignen Prostatagewebeproben nach Mikrodissektion von 17 Prostatektomiepräparaten bestimmt. Die Expressionshöhen der 16 untersuchten Kandidatengene zeigten einen weiten Bereich, der etwa von 16–37 PCRZyklen reichte (. Abb. 1). Die Gene HMBS (p=0,009), ACTB (p=0,010) und RPL13A (p=0,013) wiesen signifikant unterschiedliche Expressionen zwischen den