C. Benelli

Recent advances in the cryopreservation of shoot-derived germplasm of economically important fruit trees of Actinidia, Diospyros, Malus, Olea, Prunus, Pyrus and Vitis

This paper presents the advances made over the last decade in cryopreservation of economically important vegetatively propagated fruit trees. Cryopreservation protocols have been established using both dormant buds sampled on field-grown plants and shoot tips sampled on in vitro plantlets. In the case of dormant buds, scions are partially dehydrated by storage at -5 °C, and then cooled slowly to -30 °C using low cooling rates (c.a. 1 °C/h) before immersion in liquid nitrogen. After slow rewarming and rehydration of samples, regrowth takes place either through grafting of buds on rootstocks or excision of apices and inoculation in vitro. In the case of shoot tips of in vitro plantlets, the cryopreservation techniques employed are the following: controlled rate cooling procedures involving slow prefreezing followed by immersion in liquid nitrogen or vitrification-based procedures including encapsulation-dehydration, vitrification, encapsulation-vitrification and droplet-vitrification. The current status of cryopreservation for a series of fruit tree species including Actinidia, Diospyros, Malus, Olea, Prunus, Pyrus and Vitis is presented. Routine application of cryopreservation for long-term germplasm storage in genebanks is currently limited to apple and pear, for which large cryopreserved collections have been established at NCGRP, Fort Collins (USA), using dormant buds and in vitro shoot tips, respectively. However, there are a growing number of examples of pilot scale testing experiments under way for different species in various countries. Progress in the further development and application of cryopreservation techniques will be made through a better understanding of the mechanisms involved in the induction of tolerance to dehydration and cryopreservation in frozen explants.

In vitro propagation of persimmon (Diospyros kaki Thunb.).

Persimmon (Diospyros kaki Thunb.) is a temperate fruit tree species diffused in all continents. The traditional propagation method adopted by the nursery industry is based on budding/grafting scion cultivars on seedlings from D. kaki, Diospyros lotus, and Diospyros virginiana, the most important species used as rootstock, reproduced by seeds since they are not easy to root. Furthermore, most of nonastringent cultivars of persimmon are not compatible with D. lotus, a rootstock largely utilized because of its hardiness and frost resistance. The main in vitro tissue culture techniques, developed for persimmon, deal with direct regeneration (from dormant buds and root tips), and indirect regeneration through callus from dormant buds, apexes, and leaves. The bottlenecks of micropropagation are (1) the recalcitrance of many cultivars to in vitro establishment, (2) the low multiplication ratio of D. kaki compared to other fruit tree species, (3) the very low rooting ability of ex novo microcuttings both from direct and indirect regeneration, (4) the high sensitivity to transplant from in vitro to in vivo conditions. The development of reliable in vitro regeneration procedures is likely to play a key role for production of both clonal rootstocks and self-rooted cultivars. The general protocol for micropropagation of persimmon reported here is based on the establishment of winter dormant buds in vitro, shoot development, multiplication and elongation, and shoot rooting, using cytokinins (BA or zeatin) in a MS media along with an auxinic pretreatment for rooting induction.

КУЛТУРА ТКИВА И КРИОПРЕЗЕРВАЦИЈА КАО МЕТОДЕ ЗА ПОВЕЋАЊЕ ПРОДУКЦИЈЕ МАНГИФЕРИНА КОД БАЛКАНСКЕ ПЕРУНИКЕ (IRIS REICHENBACHII HEUFFEL)

У раду су приказани резултати анализе садржаја мангиферина, (1,3,6,7- тетрахидроксиксантон-C2-β-D-гликозид) у различитом биљном материјалу балканске ендемичне перунике (Iris reichenbachii Heuffel). Помоћу методе течне хроматографије под великим притиском (HPLC), садржај мангиферина анализиран је у биљном материјалу сакупљеном на природним стаништима, током гајења у култури in vitro, као и у регенерисаним биљкама гајеним у условима ex vitro (стакленик и башта института). Kод биљака сакупљених са природних станишта садржај мангиферина у биљном ткиву зависио је од биљног органа, као и од места где су биљке сакупљене. Током индукције регенерације биљака у култури in vitro применом културе зрелих зиготских ембриона на хранљивим подлогама обогаћеним са 2,4-дихидрофенокси сирћетном киселином продукција мангиферина у биљном ткиву зависила је од састава хранљиве подлоге као и од степена диференцијације ткива. Највећа продукција мангиферина током гајења у условима in vitro постигнута je током индукције формирања изданака док је најмања продукција мангиферина добијена у ембриогеним калусним културама где је забележена синтеза мангиферина само у траговима. После криопрезервације врхова изданака методoм витрификацијe у капљици добијен је исти ниво синтезе мангиферина у изданцима, као и пре криопрезервације. Највећи садржај мангиферина уочен је у надземним деловима биљака регенерисаних у култири ткива и аклиматизованих на спољашње услове. Садржај мангиферина код биљака добијених применом ове методе био је знатно већи него код биљака сакупљених из природних станишта. У овом раду представљен је потенцијал техника културе ткива и криопрезервације у циљу ex situ заштите једне ендемичне биљне врсте као и потенцијал ових техника за производњу секундарних метаболита као што је мангиферин. Применом ових техника може се произвести овај секундарни метаболит за потребе фармацеутске индустрије, без уништавања биљног материјала са природног станишта.