C. Postic

Molecular phenomics and metagenomics of hepatic steatosis in non-diabetic obese women

Hepatic steatosis is a multifactorial condition that is often observed in obese patients and is a prelude to non-alcoholic fatty liver disease. Here, we combine shotgun sequencing of fecal metagenomes with molecular phenomics (hepatic transcriptome and plasma and urine metabolomes) in two well-characterized cohorts of morbidly obese women recruited to the FLORINASH study. We reveal molecular networks linking the gut microbiome and the host phenome to hepatic steatosis. Patients with steatosis have low microbial gene richness and increased genetic potential for the processing of dietary lipids and endotoxin biosynthesis (notably from Proteobacteria), hepatic inflammation and dysregulation of aromatic and branched-chain amino acid metabolism. We demonstrated that fecal microbiota transplants and chronic treatment with phenylacetic acid, a microbial product of aromatic amino acid metabolism, successfully trigger steatosis and branched-chain amino acid metabolism. Molecular phenomic signatures were predictive (area under the curve = 87%) and consistent with the gut microbiome having an effect on the steatosis phenome (>75% shared variation) and, therefore, actionable via microbiome-based therapies.Metabolic activity of specific human gut microorganisms contributes to liver steatosis in obese women.

Novel Grb14-Mediated Cross Talk between Insulin and p62/Nrf2 Pathways Regulates Liver Lipogenesis and Selective Insulin Resistance

ABSTRACT A long-standing paradox in the pathophysiology of metabolic diseases is the selective insulin resistance of the liver. It is characterized by a blunted action of insulin to reduce glucose production, contributing to hyperglycemia, while de novo lipogenesis remains insulin sensitive, participating in turn to hepatic steatosis onset. The underlying molecular bases of this conundrum are not yet fully understood. Here, we established a model of selective insulin resistance in mice by silencing an inhibitor of insulin receptor catalytic activity, the growth factor receptor binding protein 14 (Grb14) in liver. Indeed, Grb14 knockdown enhanced hepatic insulin signaling but also dramatically inhibited de novo fatty acid synthesis. In the liver of obese and insulin-resistant mice, downregulation of Grb14 markedly decreased blood glucose and improved liver steatosis. Mechanistic analyses showed that upon Grb14 knockdown, the release of p62/sqstm1, a partner of Grb14, activated the transcription factor nuclear factor erythroid-2-related factor 2 (Nrf2), which in turn repressed the lipogenic nuclear liver X receptor (LXR). Our study reveals that Grb14 acts as a new signaling node that regulates lipogenesis and modulates insulin sensitivity in the liver by acting at a crossroad between the insulin receptor and the p62-Nrf2-LXR signaling pathways.

Publisher Correction: Molecular phenomics and metagenomics of hepatic steatosis in non-diabetic obese women

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P203 - La O-GlcNAcylation du facteur de transcription ChREBP contribue aux mécanismes de glucotoxicité dans la cellule bêta pancréatique

Introduction Les mecanismes de glucotoxicite se manifestent dans les cellules beta par une augmentation de la lipogenese et du stress oxydatif, ceci conduisant a une alteration de la fonction insulino-secretoire ainsi qu’a une apoptose accrue. Le facteur de transcription ChREBP, mediateur des effets transcriptionnels du glucose, est fortement exprime dans les cellules beta, ou il regule l’activite de genes du metabolisme glucidique (L-PK), lipidique (FAS, ACC…) et egalement celle de TxNIP, mediateur moleculaire des effets toxiques du glucose dans les cellules beta. L’hyperglycemie se traduit dans ces cellules par une augmentation des voies du metabolisme glucidique et particulierement de la O-GlcNAcylation, modification post-traductionnelle des proteines. Notre hypothese est que la O-GlcNAcylation de ChREBP, en augmentant son activite transcriptionnelle, contribuerait aux mecanismes de glucotoxicite dans les cellules beta via une potentialisation de l’expression des genes glycolytiques, lipogeniques et de TxNIP. Materiels et methodes Nous avons surexprime l’OGA, l’enzyme responsable de la de-glycosylation des proteines dans une lignee de cellules beta pancreatiques de rat INS1 via une approche adenovirale. Resultats La surexpression de l’OGA diminue le niveau global de proteines glycosylees et plus specifiquement la O-GlcNAcylation de ChREBP, se correlant avec une diminution de l’expression en ARN et en proteines des cibles de ChREBP : L-PK, FAS, ACC et TxNIP suggerant une lipogenese et un stress oxydatif diminues. De plus, la culture d’ilots de rat en presence d’un inhibiteur de l’OGA, conduit a une augmentation de l’expression de TxNIP. Enfin, nos resultats suggerent que TxNIP serait lui-meme O-GlcNAcyle, modification n’ayant jamais ete decrite pour cette proteine. Conclusion Nos resultats suggerent que la O-GlcNAcylation de ChREBP potentialise son activite transcriptionnelle en augmentant la transcription des genes du metabolisme glucidique et lipidique mais egalement de TxNIP. L’augmentation de la O-GlcNAcylation initiee par l’hyperglycemie chronique contribuerait aux mecanismes de glucotoxicite, via une induction accrue de la lipogenese et du stress oxydatif.

O58 Implication des protéines des gouttelettes lipidiques dans la résistance a l’insuline hépatique

Introduction La prevalence des maladies steatosiques non alcooliques du foie augmente de maniere exponentielle dans les pays industrialises. Le developpement de ces maladies se traduit par une steatose hepatique frequemment associee a une resistance a l’insuline. Cette resistance a pu etre expliquee par l’accumulation intra-hepatocytaire de lipides intermediaires tels que Ceramides et Diacylglycerols. Cependant, notre modele animal de steatose hepatique, les souris invalidees pour la proteine hepatique « Microsomal Triglyceride Transfert Protein » (Mttp Δ / Δ), ne developpent pas de resistance a l’insuline, malgre une augmentation de ces lipides intermediaires. Ceci suggere la presence d’un autre mecanisme induisant la resistance a l’insuline. Materiels et methodes L’analyse Microarray du foie des souris Mttp Δ / Δ a montre une forte up-regulation des genes « Cell-death Inducing DFFA-like Effector C (cidec) », « Lipid Storage Droplet Protein 5 (lsdp5) » et « Bernardinelli-Seip Congenital Lipodystrophy 2 Homolog (seipin) » dans le foie des souris Mttp Δ / Δ. Ces genes ont ete recemment identifies comme codant pour des proteines structurelles des gouttelettes lipidiques. Nous avons teste si ces genes jouaient un role important dans le developpement de la steatose hepatique, ainsi que de la resistance a l’insuline. Resultats Nous avons demontre que ces genes sont fortement augmentes dans d’autres modeles de souris steatosees tels que ceux presentant une sur-expression de ChREBP. Dans les hepatocytes murins (AML12 :Alfa Mouse Liver 12), l’invalidation de cidec et/ou seipin semble diminuer la phosphorylation d’AKT apres stimulation a l’insuline, suggerant une resistance a l’insuline. Chez l’homme, l’expression de ces genes est augmentee dans le foie de patients obeses avec steatose hepatique. De maniere interessante, cette augmentation est attenuee chez les patients avec resistance a l’insuline. Conclusion Ces donnees suggerent que ces proteines des gouttelettes lipidiques augmentent au cours du developpement de la steatose hepatique et que cette augmentation protege contre la resistance a l’insuline.

O40 L’Adiponutrine : un marqueur de la stéatose hépatique contrôlé par les facteurs lipogéniques ChREBP et SREBP1c

Introduction Un variant genetique I148M de l’adiponutrine ou PNPLA3 (Patatin-like phospholipase domain containing 3) a ete recemment presente comme un marqueur potentiel de la steatose hepatique. Son expression est en effet associee a une augmentation des triglycerides chez les patients ayant une steatose hepatique non alcoolique. L’adiponutrine est une proteine appartenant a une famille d’enzymes ayant une activite lipasique, mais sa fonction propre est encore inconnue. Nous avons etudie sa regulation et son implication dans le controle du metabolisme glucido-lipidique et la survenue de la steatose hepatique. Materiels et Methodes La regulation de l’expression de l’adiponutrine a ete etudiee in vivo dans le foie de souris C57Bl6/J et in vitro dans des cultures d’hepatocytes murins et d’hepatomes HepG2. L’analyse du promoteur a ete realisee par des experiences de transfection transitoire. Un adenovirus surexprimant l’adiponutrine a ete injecte dans le foie de souris C57BL/6 afin d’etudier sa fonction. Apres 3 semaines, une analyse des especes lipidiques a ete realisee. Resultats L’expression de l’adiponutrine est faible dans le foie a la suite d’un jeune et est induite lors de la realimentation avec un regime hyperglucidique. Le glucose et l’insuline, via les facteurs de transcription ChREBP et SREBP1c, sont les principaux inducteurs de son expression in vitro (hepatocytes et HepG2). Par des experiences de transfection transitoire, nous avons identifie les sites de liaison de ces facteurs sur les promoteurs murin et humain du gene de l’adiponutrine. Afin de definir la fonction de l’adiponutrine dans le developpement de la steatose hepatique, nous avons etudie les consequences de sa surexpression sur le metabolisme glucido-lipidique. De facon surprenante, l’adiponutrine entraine une diminution significative des quantites d’acides gras totaux libres et esterifies. Conclusion Nos resultats revelent que l’adiponutrine est un gene cible de ChREBP et SREBP1c. Il pourrait ainsi participer au controle de l’homeostasie energetique. L’etude des consequences fonctionnelles de la surexpression du variant I148M permettra de definir le role de cette proteine dans le metabolisme lipidique.

O45 L’inhibition de l’expression de Grb14 dans le foie améliore la tolérance au glucose et la stéatose hépatique chez la souris

Introduction L’adaptateur moleculaire Grb14 est un inhibiteur endogene de la signalisation de l’insuline qui se lie sur le recepteur active par l’insuline et en bloque l’activite catalytique. L’objectif de notre etude a ete d’inhiber a court terme l’expression de Grb14 dans le foie afin d’en etudier les consequences sur la regulation du metabolisme glucido-lipidique. Materiels et Methodes Un adenovirus exprimant un ARN interferant controle ou dirige contre Grb14 (shGrb14) a ete injecte a des souris C57Bl6 ou ob/ob. Des tests de tolerance au glucose et de sensibilite a l’insuline ont ete realises 4 jours apres l’injection. Les animaux ont ete sacrifies dans differents etats nutritionnels apres 7 jours. Les parametres metaboliques et hepatiques ont ete etudies par RT-PCRq, Western blot et dosages biochimiques. Resultats La signalisation de l’insuline est augmentee dans le foie des souris injectees avec le shGrb14 (pAkt, pERK). Ces souris presentent egalement une amelioration de la tolerance au glucose et une diminution de la glycemie quel que soit leur etat nutritionnel. Ce phenotype est associe a une diminution de l’expression des genes cles de la neoglucogenese (PEPCK, G6Pase) dans le foie des souris a jeun. Parallelement, et de facon inattendue, on observe une diminution du stockage de glycogene ainsi qu’une diminution de l’expression des genes de la lipogenese (SREBP-1c, ChREBP, ACC, FAS, SCD1) dans le foie des souris a l’etat renourri, ce qui entraine une diminution du contenu en triglycerides hepatiques. De plus, l’inhibition de Grb14 dans le foie de souris ob/ob entraine une diminution de 70 % de la steatose hepatique. Discussion Le paradoxe des effets du shGrb14 sur la neoglucogenese d’une part et sur l’inhibition de la synthese de glycogene et la lipogenese d’autre part suggere que Grb14 pourrait controler la signalisation de l’insuline en agissant egalement a une etape distale en aval du recepteur. Conclusion L’inhibition de Grb14 dans le foie entraine une amelioration de l’effet de l’insuline sur la production hepatique de glucose et une inhibition de la lipogenese. Cest effets combines de Grb14 pourraient etre benefiques pour la prevention de l’obesite et du diabete de type 2, pathologies caracterisees par une intolerance au glucose et une steatose hepatique.

PO25 Contribution de la sérine/thréonine kinase SIK2 dans le développement de la stéatose hépatique induite par les régulateurs transcriptionnels p300 et ChREBP

Introduction La prevalence de la steatose hepatique, associee a l’obesite et la resistance a l’insuline, est en augmentation dans les pays industrialises. La voie de la lipogenese (synthese de novo d’acides gras) joue un role important dans cette pathologie et contribue pour 30 % du stockage des triglycerides dans le foie. Nous avons precedemment mis en evidence le role central du facteur de transcription ChREBP, qui controle l’expression des genes de la lipogenese en reponse au glucose, dans le developpement de la steatose. Cependant les mecanismes moleculaires augmentant son activite restent a ce jour non elucides. L’objectif de notre etude a ete de comprendre les mecanismes de regulation de l’activite de ChREBP et plus precisement de determiner la contribution de la serine/threonine kinase SIK2 (Salt Inducible Kinase 2), important regulateur transcriptionnel, au developpement de la steatose induite par ChREB. Resultats Nous avons etudie, les effets de l’inhibition ciblee de SIK2 dans le foie de souris C57BL6/J. L’inhibition de l’expression de SIK2 entraine le developpement d’une steatose caracterisee par l’augmentation de l’expression des genes de la glycolyse et de la lipogenese (L-PK, ACC, FAS), associee a une augmentation du contenu en triglycerides dans le foie. SIK2 inhibe l’activite histone acetyl-transferase (HAT) du coactivateur de transcription p300 par la phosphorylation de sa serine 89. Ainsi, l’inhibition de SIK2 entraine une augmentation de l’activite HAT de p300, qui contribue a augmenter les niveaux d’acetylation de ChREBP. Cette modification post-traductionnelle permet d’augmenter l’activite transactivatrice de ChREBP dans le foie et de favoriser le developpement de la steatose hepatique. Finalement la diminution de l’activite de SIK2 dans le foie de souris ob/ob insulino-resistantes est correlee au developpement de la steatose. Conclusion En conclusion, nous demontrons que l’inhibition de l’activite de SIK2 dans un etat d’insulino-resistance, en regulant l’activite de p300 par phosphorylation, joue un role cle dans le developpement de la steatose hepatique, via l’augmentation de l’activite de ChREBP par acetylation. Une modulation de l’activite de SIK2 et/ou p300 pourrait constituer une piste interessante dans le traitement de la steatose hepatique induite au cours de l’obesite et du diabete de type 2.

O38 La O-glycosylation du facteur de transcription ChREBP stimule son activité transactivatrice et participe au développement de la stéatose hépatique

Introduction ChREBP, le mediateur des effets transcriptionnels du glucose, a ete recemment implique dans le developpement de la resistance a l’insuline et de la steatose hepatique chez les souris obese/diabetiques ob/ob. L’activite de ChREBP est stimulee par le metabolisme du glucose qui controle sa localisation nucleaire et son activite transcriptionnelle en modulant sa phosphorylation. Cependant, des donnees recentes suggerent que d’autres modifications post-traductionnelles seraient necessaires. Notre hypothese est que la O -glycosylation ( O -GlcNAc) dont les niveaux dependent du glucose et qui module l’activite de nombreux facteurs de transcription, serait impliquee dans la regulation de ChREBP. Materiels et Methodes Pour cela, quatre groupes de souris ont ete etudies : des souris temoins surexprimant la GFP soumises a un jeune de 24 h ou realimentees avec un regime hyperglucidique apres la periode de jeune et des souris surexprimant l’OGT, l’enzyme responsable de la modification des proteines par la O -GlcNAc, soumises aux memes conditions nutritionnelles. Resultats L’expression de ChREBP est faible a jeun et augmente lorsque les souris temoins sont realimentees avec le regime hyperglucidique. L’augmentation de l’expression de ChREBP coincide avec sa dephosphorylation, sa translocation nucleaire et l’induction de ses genes cibles, permettant ainsi la synthese physiologique d’acides gras au niveau du foie. La surexpression de l’OGT induit l’apparition d’une steatose hepatique chez les souris realimentees. Cette augmentation du nombre de gouttelettes lipidiques est concomitante d’une augmentation des niveaux d’expression de ChREBP, de sa forme glycosylee et de l’activation de ses genes cibles. Conclusion En conclusion, l’apport en glucides en induisant a la fois la glycosylation et la dephosphorylation de ChREBP contribuerait a la stimulation de son activite transactivatrice. Nos resultats, en demontrant le controle de ChREBP par la O -glycosylation, apportent une meilleure comprehension des mecanismes de regulation de ce facteur clef du metabolisme glucidique et lipidique.

O19 L’induction de la voie de la lipogenèse via ChREBP entraîne une stéatose hépatique sans développement d’une résistance à l’insuline

Introduction La steatose hepatique non alcoolique, frequemment associee a l’obesite, la resistance a l’insuline et le diabete de type 2, se caracterise par une accumulation excessive de triglycerides (TG) dans le foie. Les acides gras utilises pour la synthese des TG proviennent du pool plasmatique ou des acides gras neosynthetises a partir du glucose par la voie de la lipogenese. Recemment, le facteur de transcription ChREBP a ete identifie comme un determinant central du controle transcriptionnnel de la lipogenese. Ainsi, son inhibition ciblee dans le foie corrige la steatose hepatique des souris ob/ob. L’objectif de notre etude a ete de determiner si la surexpression de ChREBP dans le foie suffit a entrainer une steatose hepatique associee a une resistance a l’insuline. Materiels et methodes Un adenovirus exprimant l’ADN complementaire d’une forme constitutivement active de ChREBP a ete injecte a des souris C57Bl/6J. Apres 7 et 9 jours, des tests de sensibilite a l’insuline et de tolerance au glucose ont ete realises. Le dosage d’especes lipidiques par spectrometrie de masse et la coloration de coupes de foies a l’huile rouge ont permis d’etudier la mise en place d’une eventuelle steatose hepatique. Resultats La surexpression de ChREBP dans le foie induit de facon significative l’expression des genes de la glycolyse (L-PK) et de la lipogenese (ACC, FAS, SCD1) et ceci sans augmentation de l’expression de SREBP-1c, le mediateur des effets transcriptionnels de l’insuline sur ces genes. La surexpression de ChREBP s’accompagne d’une accumulation importante des lipides hepatiques visualises par coloration a l’huile rouge. De facon interessante, les souris surexprimant ChREBP ne sont pas resistantes a l’action de l’insuline et presentent au contraire une tolerance au glucose et une sensibilite a l’insuline ameliorees. Conclusion L’ensemble de nos resultats indique que l’induction de la lipogenese via ChREBP est suffisante pour induire une steatose hepatique mais suggere que l’accumulation intra-hepatique de lipides n’est pas toujours associee a un etat de resistance a l’insuline.