Corinne Leloup

Hypothalamic S-Nitrosylation Contributes to the Counter-Regulatory Response Impairment following Recurrent Hypoglycemia

Aims Hypoglycemia is a severe side effect of intensive insulin therapy. Recurrent hypoglycemia (RH) impairs the counter-regulatory response (CRR) which restores euglycemia. During hypoglycemia, ventromedial hypothalamus (VMH) production of nitric oxide (NO) and activation of its receptor soluble guanylyl cyclase (sGC) are critical for the CRR. Hypoglycemia also increases brain reactive oxygen species (ROS) production. NO production in the presence of ROS causes protein S-nitrosylation. S-nitrosylation of sGC impairs its function and induces desensitization to NO. We hypothesized that during hypoglycemia, the interaction between NO and ROS increases VMH sGC S-nitrosylation levels and impairs the CRR to subsequent episodes of hypoglycemia. VMH ROS production and S-nitrosylation were quantified following three consecutive daily episodes of insulin-hypoglycemia (RH model). The CRR was evaluated in rats in response to acute insulin-induced hypoglycemia or via hypoglycemic-hyperinsulinemic clamps. Pretreatment with the anti-oxidant N-acetyl-cysteine (NAC) was used to prevent increased VMH S-nitrosylation. Results Acute insulin-hypoglycemia increased VMH ROS levels by 49±6.3%. RH increased VMH sGC S-nitrosylation. Increasing VMH S-nitrosylation with intracerebroventricular injection of the nitrosylating agent S-nitroso-L-cysteine (CSNO) was associated with decreased glucagon secretion during hypoglycemic clamp. Finally, in RH rats pre-treated with NAC (0.5% in drinking water for 9 days) hypoglycemia-induced VMH ROS production was prevented and glucagon and epinephrine production was not blunted in response to subsequent insulin-hypoglycemia. Conclusion These data suggest that NAC may be clinically useful in preventing impaired CRR in patients undergoing intensive-insulin therapy.

P185 Canaux TRPC3: nouveau mécanisme impliqué dans la sensibilité hypothalamique au glucose et le contrôle de l’homéostasie énergétique

Introduction L’hypothalamus medio-basal (MBH) renferme des neurones gluco-excites impliques dans le controle de l’homeostasie glucidique. Neanmoins, les mecanismes mis en jeu dans la reponse au glucose de ces neurones sont inconnus mis a part des donnees preliminaires montrant l’implication d’especes actives de l’oxygene (EAOs). Certains canaux de la famille des « transient receptor potential-canonical ° » (TRPC), qui presentent une conductance ionique observee dans les neurones gluco-excites, sont directement modules par les EAOs. Nous avons emis l’hypothese qu’une voie de signalisation EAOs-TRPC-dependante est impliquee dans la reponse au glucose des neurones gluco-excites hypothalamiques. Materiels et methodes In vitro : l’activite de cellules dissociees de MBH de rats ou souris est enregistree par imagerie calcique en reponse a l’augmentation de la concentration en glucose de 2,5 a 10 mm, en presence d’inhibiteurs de canaux TRPC. In vivo: la secretion d’insuline induite par l’injection intra-carotidienne d’un bolus de glucose, la tolerance au glucose et a l’insuline sont etudiees en reponse a l’administration d’inhibiteurs TRPC dans le MBH chez le rat et chez des souris deficientes pour le canal TRPC3. Resultats L’intensite des reponses calciques au glucose des neurones gluco-excites diminue significativement en presence des inhibiteurs TRPC non selectifs ou TRPC3-selectifs. Ces donnees suggerent que ce canal est implique dans la reponse au glucose des neurones gluco-excites du MBH. In vivo, l’administration d’un inhibiteur TRPC3-selectif dans le MBH inhibe la secretion d’insuline induite par l’injection intracarotidienne de glucose. Les souris deficientes pour le canal TRPC3 presentent egalement un defaut de secretion d’insuline en reponse a cette injection, parallelement a une intolerance au glucose, une hyperglycemie a jeun et un surpoids. Conclusion Nos donnees mettent en evidence une nouvelle voie de signalisation EAOs-TRPC3 jouant un role clef dans la reponse au glucose des neurones gluco-excites de MBH et le controle de l’homeostasie glucidique. Declaration d’interet Les auteurs declarent ne pas avoir d’interet direct ou indirect (financier ou en nature) avec un organisme prive, industriel ou commercial en relation avec le sujet presente.

PO20 Impact des rythmes circadiens sur l’exocytose des granules d’insuline

Introduction La cellule β possede une horloge circadienne autonome regulee par les genes « horloge ». Parmi ces genes, les recepteurs nucleaires Rev-erbα et β repriment le facteur de transcription Bmal1, au cœur de l’horloge. Ces genes « horloge » couplent les rythmes circadiens au metabolisme glucidique. Rev-erbα est implique dans la secretion d’insuline en reponse au glucose en regulant notamment des genes de la machinerie d’exocytose. Une desynchronisation de l’horloge est a l’origine d’une secretion d’insuline inadaptee. Pour mieux comprendre ce mecanisme, nous avons etudie l’impact de l’horloge circadienne sur les etapes distales de l’exocytose par la cellule β. Materiels et methodes Les experiences sont realisees sur des ilots ou des cellules β de souris C57Bl/6J cultives pendant 24 heures. L’expression des genes de l’horloge est mesuree par RT-qPCR. Les courants calciques sont analyses par imagerie calcique et electrophysiologie (patch-clamp sur cellule entiere) en phase diurne (ZT4-11) et nocturne (ZT16-23). Resultats Nous montrons que les genes Rev-erbα, Rev-erbβ et Bmal1 conserve une expression oscillatoire asymetrique dans l’ilot durant 24 heures de culture. L’expression de Rev-erbα et Rev-erbβ atteint son maximum en phase diurne (ZT11) alors que Bmal1 est a son minimum. Au contraire, en phase nocturne, l’expression de Bmal1 est a son maximum lorsque celle des Rev-erbs est minimum (ZT23). Les courants calciques via les VDCCs (voltage-dependent calcium channels) de la cellule β sont eux plus importants apres depolarisation pendant la phase nocturne comparee a la phase diurne. Cependant l’induction des courants calciques en phase nocturne necessite un seuil de depolarisation plus eleve. L’analyse par imagerie calcique est en cours. Conclusion Les VDCCs de la cellule β presentent une fonctionnalite differente entre la phase d’activite en phase nocturne, et la phase de repos en phase diurne. Ceci pourrait en partie expliquer les oscillations journalieres de la secretion d’insuline. Declaration d’interet Les auteurs declarent ne pas avoir d’interet direct ou indirect (financier ou en nature) avec un organisme prive, industriel ou commercial en relation avec le sujet presente.

P217: Potentiels evoqués gustatifs chez l’Homme en réponse à une stimulation sucrée

Introduction et but de l’etude Les Potentiels Evoques Gustatifs (PEG) peuvent etre detectes en reponse a une stimulation intermittente des recepteurs gustatifs par une saveur primaire. Ils permettent d’explorer la voie sensorielle gustative depuis les bourgeons du gout jusqu’au cortex gustatif. Notre objectif etait double : (1) etablir un enregistrement fiable des PEG chez l’Homme, et (2) determiner les variations physiologiques de l’activite evoquee electrique cerebrale en regard des aires gustatives en fonction de l’intensite du stimulus puis en fonction de l’etat de jeune ou de satiete. Materiel et methodes Des sujets volontaires sains ont ete inclus. Lors d’une 1 re experience, une solution de saccharose a differentes concentrations (5, 10 ou 20xa0g pour 100xa0mL) a ete presentee de facon intermittente sur la partie mediane de la langue (20 stimuli de 1s, intervalle inter-stimuli de 1 min). Chaque seance a ete realisee au moins 2 heures apres le repas. Lors d’une 2 e experience, les PEG ont ete enregistres en fin de matinee et debut d’apres-midi, lors de 2 sessions : l’une avant puis apres un repas standardise a midi ; l’autre a jeun aux meme horaires. Dans les 2 experiences, les PEG ont ete enregistres en 9 sites avec electrodes de scalp (nomenclature 10/20) : Cz, Fz, Pz, C3, C4, F3, F4, Fp1, Fp2 (reference : oreilles liees). Les PEG ont ete obtenus par moyennage des reponses. Des seances controles avec eau seule, ou sans solution, ont egalement ete realisees. Resultats et Analyse statistique Treize sujets sains ont participe a la 1 re experience : 8 femmes et 5 hommes, âges de 25 a 34 ans (moyenne 28xa0±xa04 ans). Aucun PEG n’a ete obtenu pendant les seances controles (eau seule). Il existe une bonne reproductibilite inter et intra-individuelle lors de l’administration des solutions sapides. Il n’y a pas de difference significative en fonction du sexe, ni entre les differentes intensites des concentrations de saccharose. En revanche, a la concentration 20xa0g/200xa0mL, les sujets qui aiment beaucoup les aliments sucres ont une amplitude du PEG significativement plus grande que les sujets qui aiment peu les aliments sucres (pxa0 e experience : 8 femmes et 3 hommes (âge moyen = 28xa0±xa07 ans). Les latences des PEG sont plus allongees apres le repas, par rapport aux PEG realises a jeun (pxa0=xa00,05 a 0,01 selon les electrodes). En outre, la solution de saccharose est percue significativement plus intense apres le repas (pxa0 Conclusion Les resultats mettent en evidence la possibilite d’enregistrer de facon fiable les PEG chez l’Homme. L’enregistrement des PEG met en evidence des differences de traitement cortical de l’information en fonction de la sensation hedonique qu’induit la solution et en fonction de l’etat de rassasiement. Les mecanismes physiologiques qui sous-tendent ces resultats ne sont que pas connus. Des etudes complementaires vont etre poursuivies afin de recueillir les PEG en reponse a d’autres saveurs primaires.

Animal Models and Methods to Study the Relationships Between Brain and Tissues in Metabolic Regulation

Abstract The constant increase in the number of obese and diabetic patients, which has become a concern of public health, is the consequence of dysregulations in energy homeostasis. Communications between the brain and peripheral tissues play a critical role in this regulation. Studying the brain-periphery axis has become a critical field of research. This chapter lists a panel of concepts, approaches, tools and techniques scientists possess to study the brain-periphery axis in the regulation of energy homeostasis. We focused on techniques used in vivo to stimulate the brain such as the stereotaxy, electrical stimulation, vascular surgery and optogenetic. We described tools and approaches used to study in vivo and in vitro response of neural cells to metabolic stimuli such as electrophysiology, cellular imaging, microdialysis and c-fos mapping. Finally, approaches used to study peripheral behavioral and metabolic responses such as food intake and body weight monitoring and glucose clamps are presented.

O12 Implication de la Cx43 dans la détection hypothalamique du glucose

Introduction Lhypothalamus est fortement implique dans la regulation nerveuse de lhomeostasie glucidique. La detection de lhyperglycemie par des neurones specialises declenche des reponses adaptees comme le maintien de la glycemie ou encore le rassasiement. Les astrocytes sont suspectes participer a la detection neuronale du glucose. Ils sont organises en reseaux et presentent un grand nombre de jonctions gap (JG) permettant le passage du glucose de la circulation sanguine vers les neurones. Ces JG sont formees majoritairement de connexine 43 (Cx43). Nous avons fait lhypothese que les reseaux astrocytaires, via les Cx43 en particulier, participent a la detection hypothalamique du glucose. Materiels et methodes La distribution de la Cx43 a ete etudiee par immunohistochimie dans lhypothalamus ventro-median (VMH) chez le rat. Linhibition de lexpression de la Cx43 dans le VMH, in vivo, a ete realisee en injectant par stereotaxie des siRNA diriges contre cette proteine. Dans le but devaluer la detection hypothalamique dune augmentation de la concentration cerebrale en glucose, la secretion dinsuline ou la realimentation des animaux suite a un jeune de 20h ont ete mesures en reponse a linjection intracarotidienne dun bolus de glucose en direction du cerveau. Resultats La Cx43 est tres fortement exprimee dans les terminaisons astrocytaires autour des micro-vaisseaux du VMH. Linhibition de la Cx43 (environ 30 %) induit une diminution de la prise alimentaire 72h apres linjection sans modification du poids, de la glycemie et de linsulinemie comparee aux temoins. Suite a linjection carotidienne de glucose, la secretion dinsuline est inhibee significativement chez les animaux siCx43. De meme, leffet satietogene du glucose est fortement inhibe chez ces animaux siCx43 lors de la realimentation apres un jeune. Conclusion Ces resultats renforcent la notion selon laquelle les reseaux astrocytaires, via la Cx43, sont un des acteurs importants de la detection hypothalamique du glucose.

032 Implication de la Cx43 dans le glucose-sensing hypothalamique

Introduction L’hypothalamus est fortement implique dans la regulation de l’homeostasie glucidique. Les variations de glycemie y sont detectees par des neurones specialises, notamment dans le noyau arque : on parle de « glucose-sensing » (GS). L’integration de cette information declenche une reponse adaptee afin de maintenir la glycemie stable. L’acheminement du glucose de la circulation aux neurones implique les astrocytes. Ces derniers forment un reseau via les jonctions gap (JG) qui permet le trafic de metabolites, dont le glucose, entre astrocytes et avec le milieu extracellulaire. Ces jonctions sont formees majoritairement de connexines 43 (Cx43), hemi-canaux fortement exprimes dans l’hypothalamus. Nous recherchons la contribution possible du reseau astrocytaire, via les Cx43 en particulier, dans le GS hypothalamique. Materiels et methodes L’inhibition de la Cx43 est realisee par une approche pharmacologique qui consiste a perfuser de la carbenoxolone, un inhibiteur des JG, 20 mn chez le rat canule bilateralement dans le noyau arque et de mesurer la glycemie pendant cette perfusion. Nous developpons egalement une inhibition specifique de la Cx43 par injection de siARNs. En parallele, la Cx43 hypothalamique est quantifiee par Western Blot sur deux modeles animaux presentant des defauts du GS hypothalamique : le rat rendu hyperglycemique pendant 48 h, modele precoce pour ce defaut (reponse insulino-secretoire (RIS) prolongee) et le rat Zucker obese, insulinoresistant mais normoglycemique, ou ce defaut est installe (RIS anormalement elevee). Resultats Nos resultats preliminaires montrent que la perfusion de carbenoxolone provoque une deregulation de la glycemie, sous forme de pics hyperglycemiques irreguliers. L’approche par les siARNs est encore en cours de mise au point. Dans les deux modeles animaux choisis, on constate une augmentation de l’expression hypothalamique de la Cx43. Conclusion Ces resultats preliminaires suggerent que la Cx43 pourrait participer au GS hypothalamique en conditions physiologiques et a l’installation de ses defauts.

PO39 La fission mitochondriale induite par le glucose est indispensable à la signalisation ROS lors de la détection hypothalamique de l’hyperglycémie

Introduction Nous avons montre que la detection hypothalamique de l’hyperglycemie (HG) fait intervenir une signalisation ROS d’origine mitochondriale, laquelle est indispensable aux reponses effectrices, dont la secretion d’insuline. Par ailleurs, des etudes recentes montrent que la morphologie des mitochondries varie lors de l’HG, morphologie qui est dependante de la dynamique mitochondriale, modifiant alors la production de ROS. Ainsi, l’inhibition de la fission mitochondriale diminue la production de ROS lors d’une hyperglycemie dans l’hepatocyte par exemple. Objectif Comprendre si, in vivo, la signalisation par les ROS lors du « glucose sensing » hypothalamique, implique la dynamique mitochondriale, et plus particulierement la fission. Materiels et Methodes : L’inhibition de Drp1 (fission), est realisee par transfection de siRNA en cultures hypothalamiques pour la validation des siRNA, soit par injection dans le noyau arque de rat, les animaux temoins sont transfectes par un siRNA controle. L’inhibition est evaluee par l’etude du reseau mitochondrial ( in vitro ) et Western blot ( in vivo ). La prise alimentaire (PA), le poids, la glycemie et l’insulemie sont suivis avant et apres transfection (5 jours). La detection du glucose dans l’hypothalamus est evaluee par cfos, marqueur d’activation cellulaire, et en termes de production de ROS apres injection d’un bolus de glucose par la carotide, laquelle declenche un pic de secretion d’insuline. Resultats L’inhibition de la fission mitochondriale dans le noyau arque entraine une inhibition de la sensibilite au glucose. Ceci se traduit par la diminution de production de ROS lors de l’injection de glucose vers le cerveau dont la consequence est une diminution de la secretion d’insuline. Ceci entraine egalement des defauts de regulation de la PA : les animaux ayant recu les siRNA Drp1 presentent une augmentation de leur prise alimentaire, qui se traduit par un gain de poids plus important que chez les rats siRNA temoins. Conclusion Ces resultats montrent que la morphologie mitochondriale est requise pour la detection du glucose par le NA hypothalamique, en termes de regulation de la PA et de secretion d’insuline.