Daniel Boucher

Influence of oxygen tension on function of isolated spermatozoa from ejaculates of oligozoospermic patients and normozoospermic fertile donors.

Oxygen radical generation is known to be detrimental to sperm function. An example of a reactive oxygen species-associated male pathology is oligozoospermia in which fertilization and pregnancy rates are low in in-vitro fertilization (IVF) programmes. As the extent of the modifications induced by reactive oxygen species (ROS) depends on several factors, notably from oxygen tension in the incubation medium, the aim of this study was to examine the influence of a low (5%) rather than atmospheric (20%) oxygen tension in the incubator gas phase on the function of Percoll-selected spermatozoa from ejaculates of oligozoospermic patients and normozoospermic fertile donors. After incubation for several hours in a gas phase of either 5% CO2/90% N2/5% O2 or 5% CO2/95% air (20% O2), none of the parameters investigated, e.g. movement characteristics, potential of spermatozoa to acquire hyperactivated motility, to undergo the acrosome reaction when challenged with a calcium ionophore and to fuse with zona-free hamster oocytes, was significantly different between the two oxygen tensions in fertile donors. In contrast, among oligozoospermic patients, the motility parameters, the percentage of hyperactivated motility and of induced-acrosome reaction were significantly improved under a gas phase of 5% O2 compared with those observed under an atmosphere of 20% O2 (P < 0.05). Exposure to 5% rather than 20% oxygen tension also induced a significant increase in the percentage of penetration of zona-free hamster eggs after capacitation for 17 h, but no difference was found in the mean number of bound spermatozoa per oocyte. After incubation for 24 h, a significantly higher survival rate was observed under 5% compared with 20% oxygen tension. These results show that the use of a low oxygen tension rather than air might improve spermatozoan competence of oligozoospermic patients during IVF programmes.

Birth after combination of cryopreservation of sperm recovered from urine and intracytoplasmic sperm injection in a case of complete retrograde ejaculation

OBJECTIVEnTo assess whether sperm recovered from postejaculatory urine and cryopreserved can be used successfully for intracytoplasmic sperm injection (ICSI).nnnDESIGNnCase report.nnnSETTINGnLaboratory of Developmental and Reproductive Biology, University Hospital.nnnPATIENT(S)nA couple with male infertility resulting from complete retrograde ejaculation.nnnINTERVENTION(S)nFreezing of sperm recovered from urine and subsequent use for ICSI.nnnMAIN OUTCOME MEASURE(S)nSurvival, maintenance of fertilization, and pregnancy potential of sperm recovered from urine and cryopreserved.nnnRESULT(S)nOn thawing, the sperm were still alive (32% viability) and very slightly motile (2% sluggish motility). Of 16 oocytes injected, 10 (62.5%) produced normal, cleaving embryos. A twin pregnancy with the birth of two healthy infant girls was achieved after the transfer of three embryos.nnnCONCLUSION(S)nThe birth of normal, healthy female infants after ICSI with sperm recovered from postejaculatory urine and then cryopreserved demonstrates the usefulness of freezing such sperm even if motility is very low, to avoid surgery in the patient.

Testosterone, androstenedione, progesterone and 17α-hydroxyprogesterone in plasma and testes of immature rats under basal conditions and after hcg stimulation. Effect of bilateral cryptorchidism

Rats were made bilaterally cryptorchid at 21 days of age; sham-operated rats were used as controls. At 35 days, the animals were injected i.m. with saline or with 10 IU hCG. Progesterone, 17-hydroxyprogesterone, androstenedione and testosterone were measured in both testes and plasma under basal conditions and 2, 4, 8, 12, 24 and 72 h respectively after injection. The plasma levels and intratesticular contents of the steroids were generally lower in cryptorchid rats. The patterns of the steroid response to hCG were similar in both groups: in the testes and in the plasma, they increased acutely following hCG injection (except testicular androstenedione), then, after 72 h, returned to normal values in the plasma but remained higher than the basal values in the testes. These results suggest that there are no gross abnormalities in the testicular steroidogenic pathways and that the mechanism of action of hCG on the Leydig cells is unaltered in bilaterally cryptorchid immature rats.

Effets sur le spermatozoïde humain du Diuron (3-(3,4-dichlorophényl)-1,1-diméthyl-urée) et de l’un de ses produits de transformation, la 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA) (Etude préliminaire)

RésuméLe Diuron est un herbicide appartenant à la famille des halogénophénylurée. Un test de toxicité basé sur l’inhibition de la bioluminescence d’une bactérie marineVibrio fischeri, comme indicateur de toxicité a montré que les produits de bio- ou photo-transformation sont plus toxiques que le Diuron lui-même. Tous ces composés sont des molécules très lipophiles et une membrane cellulaire riche en lipides comme celle du spermatozoïde pourrait être une cible privilégiée pour leur interaction avec la cellule. Des études sont en cours dans notre laboratoire afin d’évaluer les effetsin vitro du Diuron et de l’un de ses produits de transformation, la 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA) (obtenu par élimination de la fonction urée) sur les propriétés structurales et fonctionnelles du spermatozoïde humain. Les études sont réalisées sur des spermatozoïdes provenant de spermes normaux (critères de l’OMS), purifiés sur gradient discontinu de Percoll. Trois millions de spermatozoïdes/ml sont incubés dans un milieu synthétique de Earle dépourvu de rouge de phénol, supplémenté par 7,5% de sérum humain décomplémenté pendant 24 heures, à température ambiante, en présence de Diuron ou de 3,4-DCA (0,1; 1; 5 mM) dans un volume final de 250 μl. Nos premiers résultats mettent en évidence une diminution de la vitalité et de la mobilité des spermatozoïdes après 24 heures d’incubation en présence de 5 mM de Diuron. L’anisotropie (inversement proportionnelle à la fluidité membranaire) mesurée par polarisation de fluorescence en utilisant une sonde lipophile, le 1,6-Diphényl-1,3,5-Hexatriène est aussi diminuée. La 3,4-DCA entraîne des effets plus rapides et plus marqués que le Diuron. Tous les spermatozoïdes sont “morts” après 30 minutes ou 24 heures d’incubation, en présence respectivement de 5 mM et 1 mM de 3,4-DCA. Aux concentrations utilisées, ces molécules s’avèrent plus toxiques pour le spermatozoïde et cet effet semblerait être lié à une atteinte membranaire. Cette étude préliminaire suggère que des tests puissent être développés à partir des spermatozoïdes humains pour évaluer la toxicité de certains pesticides.AbstractDiuron belongs to the family of halogenophenylureas, one of the main groups of herbicides used for more than 40 years. These herbicides absorb sunlight and can be photochemically transformed in the environment (herbicides are transformed on the soil surface exposed to sunlight) or biotransformed by microorganisms present in soil or in water. The metabolites (chlorohydroxyphenylurea, chlorophenylaniline, respectively) are more toxic than the parent compound, as demonstrated by a bioluminescence inhibition assay performed with a marine bacterium (Vibrio fischeri toxicity test). The lipophilicity of these pesticides makes the cell membrane a target for their action, especially the spermatozoa cell membrane. The aim of this study is to use human spermatozoa to evaluate the effect of this urea pesticide and its biotransformed product on the spermatozoa membrane.We investigated the structural and functional effects of these environmental pollutants on spermatozoa. Three million spermatozoa purified on a 95/47.5% Percoll gradient were suspended in 250 μl of modified Earle’s medium (without phenol red) supplemented with 7.5% of human decomplemented serum. Pesticides (Diuron or 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA)) were added at a final concentration of 0.1; 1 and 5 mM. Samples were incubated at room temperature for 24 hours. We show that both Diuron and 3,4-DCA decrease motility and vitality of spermatozoa incubated with the highest concentration of pesticides. Our preliminary results show that the effects are more rapid and more intense with the biotransformed product (3,4-DCA) than with Diuron. Addition of herbicide to human spermatozoa increases membrane fluidity, assessed by measuring the fluorescence polarisation anisotropy with a fluorescent probe: 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH). Changes in membrane fluidity may be a primary toxic effect of these herbicides.These results suggest that human spermatozoa may constitute a valuable indicator of the toxic effects of pesticides.

Utilisation des spermatozoïdes testiculaires en ICSI. Intérêt de la culture in vitro. Revue de la littérature

RésuméAu cours de ces dernières années les tentatives d’ICSI réalisées avec des spermatozoïdes testiculaires se sont considérablement accrues. Cependant, l’une des difficultés techniques tient au fait que la mobilité des spermatozoïdes est extrêmement réduite. Un accroissement de la mobilité avait été observé après une incubation des prélèvements testiculaires pendant quelques heures. Dans l’optique d’augmenter les chances de succès, une culture in vitro des spermatozoïdes, préalable à l’ICSI, a été envisagée. Nous rapportons ici la revue de la littérature sur ce sujet.Dans les azoospermies obstructives, la culture in vitro présente peu d’intérêt puisque, excepté une éventuelle “maturation” des spermatozoïdes pendant cette période, un pourcentage appréciable de spermatozoïdes mobiles est souvent observé rapidement après le traitement de la biopsie.Dans les azoospermies non obstructives la culture in vitro paraît justifiée, puisque lorsque l’on retrouve des spermatozoïdes dans la biopsie, ils sont généralement immobiles. Cependant, la plupart des auteurs s’accordent à reconnaître que les résultats restent aléatoires: au terme de la culture, soit il existe un gain de mobilité, soit au contraire la plupart des spermatozoïdes sont morts.Quelque soit le type d’azoospermie, les meilleurs résultats sont obtenus après 3–4 jours de culture. La supplémentation des milieux de culture avec de la FSH recombinante s’avère aussi efficace.La culture in vitro peut être associée à la congélation des spermatozoïdes et la séquence culture in vitro/congélation donnerait de meilleurs résultats que la séquence congélation/culture in vitro.Les quelques travaux sur l’utilisation en ICSI des spermatozoïdes maintenus en culture in vitro pendant 1 à 2 jours rapportent des résultats satisfaisants en terme de taux de fécondation et de grossesse.La culture in vitro de spermatozoïdes testiculaires peut constituer une voie de recherche intéressante pour améliorer les résultats en ICSI, dans les cas où la quantité de spermatozoïdes retrouvée et/ou leur mobilité sont très faibles. De plus, elle nous paraît être un bon modèle d’étude des mécanismes d’acquisition de la mobilité des spermatozoïdes.AbstractThe number of ICSI cycles performed with testicular spermatozoa has increased dramatically over recent years. However, one of the technical limitations of this approach concerns the extremely reduced motility of testicular spermatozoa. However, increased sperm motility was observed after incubating testicular samples for several hours. Therefore, in order to improve ICSI success rates, several authors have tested the effect of previous in vitro culture. We present a review of the literature on this subject.In vitro culture does not appear to be very useful in cases of obstructive azoospermia, as, apart from possible sperm “maturation” during this culture phase, a high proportion of motile spermatozoa is usually already observed prior to in vitro culture.The benefits of in vitro culture appear to be greater in the case of non-obstructive azoospermia, as when spermatozoa are present on the biopsy, they are usually immobile. However, discordant results have been published: after in vitro culture, spermatozoa have been reported to be either motile or mostly dead.Regardless of the type of azoospermia, the best results are obtained after 3–4 days of in vitro culture. Addition of recombinant FSH to the culture medium also appears to be effective.Cryopreservation of testicular biopsies may also be associated with in vitro culture and the in vitro culture/freezing sequence appears to give better results than the freezing/in vitro culture sequence.Very few studies have reported the results of ICSI using frozen in vitro cultured spermatozoa, as most published studies concern fresh spermatozoa, used after 1–2 days of in vitro culture with satisfactory fertilization and pregnancy rates.In vitro culture of testicular spermatozoa may therefore constitute an interesting research approach to improve the results of ICSI when the number of spermatozoa and/or motility are very low. In addition, in vitro culture of testicular spermatozoa appears to be a good tool to study the mechanisms of acquisition of motility, which are still poorly understood.

Prostasomes, dérivés actifs de l'oxygène et sperme humain

RésuméLes prostasomes sont des vésicules lipidiques particulières sécrétées par la prostate humainne et retrouvées dans le sperme. Actuellement, aucune action spécifique ne leur a été attribuée. Cependant, les prostasomes semblent exercer un effet à différents niveaux. Par exemple, les prostasomes sont bénéfiques pour la mobilité des spermatozoïdesin-vitro et participent à l’immunomodulation exercée par le liquide séminal.La production de dérivés actifs de l’oxygène (DAO) dans le sperme humain joue un rôle sur les capacités fonctionnelles des spermatozoïdes. La production de quantités faibles et contrôlées de DAO par les spermatozoïdes semble nécessaire à l’acquisition de leur capacités fonctionnelles. Par contre, la présence de leucocytes dans le sperme, associée à une forte production de DAO, peut se révéler néfaste pour les spermatozoïdes.Après avoir abordé, sous forme d’une revue bibliographique, les caractéristiques structurales et fonctionnelles des prostasomes et le rôle des DAO dans le sperme humain, nous rapportons nos résultats concernant les effets des prostasomes sur la production des DAO et les conséquences sur les spermatozoïdes. Nous avons mis en évidence une fonction antioxydante des prostasomes dans le sperme humain. Elle s’exerce à la fois sur les polynucléaires neutrophiles et sur les spermatozoïdes. Le mode d’action des prostasomes est particulier puisqu’ils interviennent sur la production des DAO, en agissant notamment au niveau des membranes des polynucléaires neutrophiles. Ils entraînent une diminution de l’activité NADPH-oxydase de ces cellules associée à une rigidification de leur membrane plasmique. Au niveau des spermatozoïdes, les prostasomes protègent leurs capacités fonctionnelles lors d’un stress oxydant crée par la présence de NADPH dans le milieu.AbstractProstasomes are particular lipid vesicles secreted by the human prostate and found in the semen. No specific action has yet been attributed to prostasomes, but they appear to act at various levels. For example, prostasomes enhance sperm motility in vitro and participate in the immunomodulation properties of seminal plasma.Excessive production of reactive oxygen species (ROS) in human semen has a negative influence on the functional capacities of spermatozoa. The presence of leukocytes in semen is associated with increased production of ROS that can be harmful to sperm cells, under certain conditions. Previous results tend to suggest a possible role of prostasomes on ROS production in human semen.After reviewing the literature concerning the structural and functional characteristics of prostasomes and the role of ROS in human semen, we report our results concerning the influence of prostasomes on ROS production and the consequences on semen. We have demonstrated that prostasomes exert an antioxidant function in human semen. This function is effective both on polymorphonuclear neutrophils and on sperm cells. The mechanism of action of prostasomes is unusual, as they act on ROS production mainly on the plasma membranes of neutrophils. They induce a decrease of NADPH-oxidase activity associated with rigidification of the plasma membrane. Prostasomes protect the functional capacities of spermatozoa during an oxidative stress created by the presence of NADPH in the incubation medium.

Fertilité de l’homme en fonction de l’âge

RésuméL’objet de ce travail est d’analyser l’évolution des caractéristiques spermiques en fonction de l’âge.Pour cette étude, nous avons analysé le spermogramme de 2126 hommes âgés de 20 à 64 ans qui ont consulté, dans le service de reproduction humaine de Clermont-Ferrand de 1980 à 1994, pour indications féminines d’une fécondation in vitro.La recherche d’une liaison, entre l’âge du patient au moment du spermogramme et 10 paramètres spermiques, par l’étude d’une régression linéaire, n’a pas permis de mettre en évidence de corrélation significative entre l’âge et les paramètres étudiés.La comparaison des valeurs moyennes par classes d’âge de 5 ans, a été effectuée pour le volume, la concentration en spermatozoïdes, le pourcentage de formes mobiles (normale, diminuée), le pourcentage de formes typiques et mobiles et le pourcentage de formes anormales.Ces valeurs ne diffèrent pas significativement selon les classes d’âge étudiées.Entre 20 et 60 ans, les paramètres essentiels de spermogramme semblent, en moyenne, indépendants de l’âge, ce qui permet de penser que la qualité de l’éjaculat est conservée jusqu’à 50/60ans.Cependant, un biais de recrutement de la population étudiée et un grand étalement des valeurs pour un âge donné peuvent expliquer que nous n’ayons pas décelé des fluctuations des caractéristiques spermiques liées à l’âge.AbstractThe aim of this work was to analyse the evolution of sperm characteristics according to age.To this end we analysed the spermogram of 2,126 men aged 20 to 64 who came for consultation for feminine indications for in vitro fertilization at the Clermont-Ferrand Human Reproduction Unit during the period 1980 to 1994.A search for a link between the age of the patient at the time of the spermogram and 10 sperm parameters, by studying a linear regression, did not reveal any evidence of a significant correlation between the age and the parameters studied.The mean values for volume, concentration of spermatozoa, percentage of mobile forms (normal, diminished), percentage of typical and mobile forms and percentage of abnormal forms were compared for age classes covering 5 years.These values showed no significant difference according to the age classes.Between 20 and 60 years the essential parameters of the spermogram seem generally to be independent of age, from which it can be deduced that ejaculate quality remains the same until 50 years of age.However a bias in the recruitment of the population studied and a very wide spread for the values for a given age mean that we may not have detected fluctuations in sperm characteristics linked with age.

Androgenic function in adult rats : influence of the pineal gland of the mother and of the offspring

Abstract: Female rats exposed to long (LD 18:6) or short (LD 6:18) photoperiods from 21 days of age were mated when they reached 55 days of age. On day 2 of gestation animals of each group were either pinealectomized or sham‐operated. Lighting regimens were not changed during the course of the study. Male offspring of the four groups of dams were sacrificed on day 70 after birth. Rats that were maintained on long photoperiod had higher testicular testosterone, androstenedione, and dihydrotestosterone content than those raised on a LD 6:18 cycle. Whatever the breeding photoperiod used, maternal pinealectomy induced no modification of reproductive function. Among rats kept in short photoperiod, neonatal pinealectomy (on day 5 after birth) resulted in an enhanced testicular androgen content without any modification of plasma androgen concentration. These results indicate that (1) the previously reported effect of the mothers pineal on pubertal rat testicular function is not present in adulthood and (2) the pineal of the offspring is required to maintain normal testicular androgen content in the adult rat but exerts no influence on circulating androgens.