Daniel Myrtek

IL‐6 and IL‐8 release is mediated via multiple signaling pathways after stimulating dendritic cells with lysophospholipids

Lysophosphatidic acid (LPA) and sphingosine 1‐phosphate (S1P) are bioactive lipid mediators, which are known to play major roles in allergic reactions as well as in tumor pathogenesis. Here, the biological activities and signal pathways of these lysophospholipids (LPLs) in dendritic cells (DCs) were characterized further. Flow cytometric and immunoblot analyses indicate that immature as well as mature DCs express the LPL receptors S1P1, S1P3, S1P5, and LPA2, but not S1P2, S1P4, LPA1, or LPA3. Moreover, enzyme‐linked immunosorbent assay experiments demonstrate that simultaneous addition of these LPLs to immature DCs in the presence of lipopolysaccharide enhanced the secretion of the inflammatory cytokines interleukin (IL)‐6 and IL‐8 in maturing DCs. In contrast, no modification of IL‐6 or IL‐8 release was observed after exposure of mature DCs to LPLs alone. In addition, studies with pertussis toxin and mitogen‐activated protein kinase (MAPK) kinase inhibitor PD98059 suggested that Gi proteins and MAPK pathway are involved in these LPL‐induced cell responses. Corroborating these findings, we observed that LPLs induce the phosphorylation of extracellular signal‐regulated kinase 1/2 in immature DCs but not in mature DCs. Further analyses show that inhibitors of phosholipase D, Rho, and protein kinase C also inhibited the LPL‐induced release of IL‐6 and IL‐8. Therefore, our findings suggest that lipopolysaccharide in DCs uncouples LPL receptors from the signal‐transducing machinery during maturation and that exposure of LPLs at early time‐points to maturing DCs modifies the proinflammatory capacity of mature DCs.

Lysophosphatidic Acid Induces Chemotaxis, Oxygen Radical Production, CD11b Up-Regulation, Ca2+ Mobilization, and Actin Reorganization in Human Eosinophils via Pertussis Toxin-Sensitive G Proteins

Lysophosphatidic acid (LPA) is a bioactive lipid mediator, which is generated by secretory type II phospholipase A2 and is thought to play a major role in the pathogenesis of atopic diseases. In this study, the biological activity of LPA on human eosinophils was characterized. We showed by reverse transcription and PCR that human eosinophils express the mRNA of the LPA receptors endothelial differentiation gene (EDG)-2 and EDG-7. Experiments revealed that LPA has chemotactic activity toward eosinophils, stimulates the production of reactive oxygen metabolites, and induces up-regulation of the integrin CD11b. Signal pathway measurements indicated Ca2+-mobilization from intracellular stores and transient actin polymerization upon stimulation with LPA. Cell responses elicited by LPA were inhibited by pertussis toxin indicating that in eosinophils the LPA receptor(s), presumably EDG-2 and/or EDG-7, are coupled to Gi/o proteins. Moreover, LPA-induced activation of eosinophils could be completely blocked by the EDG-2/EDG-7 antagonist diacylglycerol pyrophosphate. In addition, at optimal doses the changes induced by LPA were comparable to those obtained by the other well-characterized chemotaxins. These results indicate that LPA is a strong chemotaxin and activator of eosinophils. These findings point to a novel role of LPA in the pathogenesis of diseases with eosinophilic inflammation such as atopic diseases as chemotaxin as well as activator of proinflammatory effector functions.

Activation of Human Alveolar Macrophages via P2 Receptors: Coupling to Intracellular Ca2+ Increases and Cytokine Secretion

Alveolar macrophages play a crucial role in the pathogenesis of inflammatory airway diseases. By the generation and release of different inflammatory mediators they contribute to both recruitment of different leukocytes into the lung and to airway remodeling. A potent stimulus for the release of inflammatory cytokines is ATP, which mediates its cellular effects through the interaction with different membrane receptors, belonging to the P2X and P2Y families. The aim of this study was to characterize the biological properties of purinoceptors in human alveolar macrophages obtained from bronchoalveolar lavages in the context of inflammatory airway diseases. The present study is the first showing that human alveolar macrophages express mRNA for different P2 subtypes, namely P2X1, P2X4, P2X5, P2X7, P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y13, and P2Y14. We also showed that extracellular ATP induced Ca2+ transients and increased IL-1β secretion via P2X receptors. Furthermore, extracellular nucleotides inhibited production of IL-12p40 and TNF-α, whereas IL-6 secretion was up-regulated. In summary, our data further support the hypothesis that purinoceptors are involved in the pathogenesis of inflammatory lung diseases.

Chemotactic activity of extracellular nucleotideson human immune cells.

Purinergic P2 receptors are a class of plasma membrane receptors that are express in many tissues and are ligated by extracellular nucleotides [such as adenosine triphosphate (ATP), adenosine diphosphate (ADP), uridine 5–triphosphate (UTP) and uridine 5–diphosphate (UDP)], which are released as a consequence of cell damage, cell stress, bacterial infection or other noxious stimuli. According to the molecular structure, P2 receptors are divided into two subfamilies: P2X and P2Y receptors. The P2X receptors are ligand-gated channels, whereas P2Y receptors are G-protein-coupled seven-membrane-spanning receptors. Several studies indicate that nucleotides play an important role in immune response modulation through their action on multiple cell types, including monocytes, mast cells, dendritic cells, neutrophils, and eosinophils. Recent work by our group and others identified extracellular nucleotides as chemotaxins for various human immune cells, including eosinophils, neutrophils and dendritic cells. In this review, we summarise recent findings in this field and put forward a hypothesis on the role of P2 receptors in the early recruitment of human immune cells to the site of inflammation.

Die Zelle: leben, fressen, sterben

„Tot oder lebendig“ – dieser Ausdruck zierte fruher die Steckbriefe vieler Gesetzloser und ist auch heutzutage fur jeden Experimentator, der sich mit Zellen beschaftigt, noch aktuell. Die unterschiedlichsten Fragestellungen erfordern die Bestimmung der Viabilitat von Zellen. Dazu gehoren beispielsweise Cytotoxizitatsstudien. Interessiert man sich fur die Aktivitat bestimmter Enzyme, so ist es fur eine Standardisierung der Enzymaktivitat unerlasslich, die Anzahl lebender Zellen zu bestimmen. Auch die Messung sezernierter Zellmetabolite in Kulturuberstanden erfordert eine Viabilitatsbestimmung der Zellen, da diese im Todesfall ihr Innerstes in das Medium entlassen. Diese „Innereien“ konnen cytotoxisch wirken und sehr stabile Enzyme wie zum Beispiel Proteasen und Nucleasen enthalten, die bei ihrer Freisetzung die Messergebnisse gewaltig durcheinander bringen und dem Experimentator schlaflose Nachte und Albtraume bescheren konnen.

Ein kurzer Ausflug in die ungeliebte Welt der Statistik

„Statistik… nein danke!“ Man lehnt sich wohl nicht gerad’ weit aus dem Fenster bei der Behauptung, dass derartige Gedanken uns allen schon einmal durch den Kopf gingen. Andererseits steht es auser Frage, dass man im Laufe eines Laborlebens nicht an der Statistik vorbeikommt. An diese Tatsache wird man immer dann erinnert, wenn Fragen durch das Labor schallen wie z. B.: „Welchen Signifikanztest muss ich hier eigentlich anwenden?“ oder „Muss ich hier das arithmetische Mittel oder den Median berechnen?“ Die Reaktionen der Kollegen reichen von verschamtem Abwenden bis hin zum genervten Augenrollen – glucklich darf sich wahnen, wer auf statistische Kompetenz trifft. Im folgenden Kapitel soll der Versuch unternommen werden, einen fur das alltagliche Laborleben relevanten Ausschnitt aus dem weiten Gebiet der Statistik komprimiert, verstandlich und dabei auch noch interessant aufzubereiten.

Naturwissenschaft vs. Übernatürliches

Sie sind uberrascht, den Begriff „ubernaturlich“ in einem naturwissenschaftlichen Methodenbuch zu lesen? Glauben Sie uns, das ist gar nicht so weit hergeholt. Aber lassen Sie uns am Anfang beginnen.

in situ-Immunlokalisation

Mit dem Aufkommen spezifischer Antikorper wurde der klassischen Histologie/Cytologie ein neues Werkzeug zur Identifikation verschiedenster Zell- und Gewebebausteine, insbesondere deren Proteinkomponenten, zur Verfugung gestellt. Daraufhin entwickelte sich ein Arbeitsgebiet, das je nach Autor unterschiedlich betitelt wird – meist mit Immunhistologie, Immunhistochemie oder Immuncytochemie. Obwohl die Begriffe implizieren, dass auf histologischer Ebene bzw. auf zellularer Ebene gearbeitet wird, werden die Begriffe in der Literatur zumeist nicht streng voneinander getrennt verwendet. Samtlichen Methoden dieser Branche ist die Art der Detektion relevanter Proteine gemein. Sie erfolgt unter Ausnutzung spezifischer Antigen-Antikorper-Bindungen. Daher wird im Folgenden zusammenfassend von in situ-Immunlokalisation die Rede sein. Die Auswertung erfolgt im Allgemeinen lichtmikroskopisch und/oder elektronenmikroskopisch, wobei sogar eine „gewisse“ Quantifizierung der relevanten Proteine moglich ist – sofern die Praparation es hergibt und die erforderliche mikroskopische Ausstattung inkl. adaquater Imagingsysteme vorhanden ist. Die Aufgabe des Antikorpers ist es – wie immer – sein spezifisches Antigen im Gewebe bzw. in/an der Zelle zu finden und zu binden. Damit allein ist es noch nicht getan, denn nackte Antikorper sieht man ja bekanntermasen irrsinnig schlecht. Daher markiert man den Antikorper mit irgendetwas Wahrnehmbarem, woruber dann der Antigen-Nachweis erfolgt. Als Markierung kommen Fluorochrome und Enzyme sowie korpuskulare Anhangsel zum Einsatz. Deren Visualisierung erfordert unterschiedliche Detektionssysteme. Fluorochrome absorbieren und emittieren Licht bestimmter Wellenlange – folglich benotigt man ein Fluoreszenzmikroskop. Enzyme benotigen ein spezifisches Substrat, das nach seiner Umsetzung die relevanten Strukturen farblich markiert – hier ist lediglich ein Lichtmikroskop vonnoten, ebenso bei korpuskularen Markierungen, im Wesentlichen kolloidales Gold. Letzteres wird auch gern genutzt, um elektronenoptisch noch tiefere, subzellulare Einblicke zu erhaschen.

Immunologie in der klinischen Anwendung

Bestimmt kann jeder von uns die Frage nach seiner Korpergrose und nach seinem Gewicht – auch wenn so mancher nicht gerne daruber spricht – genau beantworten. Wird man aber nach einer anderen, und dazu sogar noch praktisch unveranderlichen, individuellen Eigenschaft, namlich der der Blutgruppe gefragt, mussen sich mit Sicherheit viele unter uns eingestehen, dass sie dies nicht mit Gewissheit beantworten konnen.