E. Bourgogne

Development, validation and clinical application of a LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of hydroxychloroquine and its active metabolites in human whole blood

A rapid, sensitive and specific method using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry was developed for the simultaneous quantification of hydroxychloroquine (HCQ) and its three major metabolites in human whole blood. The assay, using a sample volume of 100μL, was linear in a dynamic 25-2000ng/mL range (R(2)>0.99) for all four compounds and suitable for the determination of elevated HCQ concentrations up to 20,000ng/mL, after appropriate sample dilution. Inter- and intra-assay precisions were <18.2% and accuracies were between 84% and 113% for any analyte. No matrix effects were observed. The assay was successfully applied to a blood sample obtained from one poisoned patient following a massive HCQ self-ingestion resulting in an estimated concentration of 19,500ng/mL on hospital admission. In this patient, HCQ metabolites were identified and quantified at 1123, 465 and 91ng/mL for monodesethylhydroxychloroquine, desethylchloroquine and bisdesethylchloroquine, respectively. Further investigations are still required to assess the usefulness of the simultaneous measurement of blood concentrations of HCQ and its three active metabolites for monitoring HCQ treatment and managing HCQ poisoning.

Are empty methadone bottles empty? An analytic study

BackgroundMethadone maintenance treatment is the most widely prescribed treatment for opiate dependence with proven benefits for patients. In naïve users or in case of recreational misuse, methadone can be a source of potentially lethal intoxications, resulting in fatal overdoses. A few cases of infantile intoxications have been described in the literature, some of which resulted in death. Nowadays, more than 50,000 bottles are used every day in France, most of which are thrown away in the bin. Relatives at home, especially children, can have access to these empty bottles. This study aims to determine whether the residual quantity of methadone in the bottles is associated with a risk of intoxication for someone who has a low tolerance to opiates, such as a child.MethodsThe methadone dosage left in a sample of 175 bottles recapped after use by the patients taking their maintenance treatment in an addiction treatment program centre was analysed during a 2-week period in March 2013.ResultsThe mean residual quantity of methadone left in each bottle after use is 1.9u2009±u20091.8xa0mg and 3.3u2009±u20092.4xa0mg in the sample of 60xa0mg bottles.ConclusionsThere is a potential danger of accidental overdose with empty bottles of methadone syrup, especially for children. To take into account this hazard, several harm reduction strategies can be proposed, such as favouring the taking of the treatment within the delivery centres rather than the ‘take home’ doses, asking methadone users to bring back their used bottles, and raising patients’ awareness of the intoxication risks and the necessary everyday precautions. For stable patients with take home methadone, the use of capsules could be considered.

Rugged and accurate quantitation of colchicine in human plasma to support colchicine poisoning monitoring by using turbulent-flow LC–MS/MS analysis

BACKGROUNDnColchicine is a common drug used in inflammatory diseases. The narrow therapeutic index requires fast and reliable techniques for its quantitation. An online, automated sample preparation using TurboFlow™ technology combined with triple-stage quadrupole MS detection was applied to identify colchicine in human plasma and follow intoxications.nnnMETHODOLOGYnPlasma samples (200 µl) were mixed with deuterated colchicine and protein precipitation ZnSO4 solutions. After centrifugation, supernatants were extracted onto a Cyclone P TurboFlow column and eluted onto a narrowbore Hypersil™ GOLD column with a methanol/water gradient. Analytes were monitored in SRM mode (positive electrospray).nnnRESULTSnTotal run time was 9.5 min. Calibration curves ranged from 0.342 to 17.1 ng/ml, with significant linearity (R(2) >0.99). Inter- and intra-assay precisions were <16.8% and accuracy was 84.4-110%.nnnCONCLUSIONnThis method is suitable for monitoring intoxication in patients undergoing chronic treatment and is routinely applied to toxicological samples.

Off-line solid phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the quantitation of brivaracetam acid metabolites: Method validation and application to in vitro metabolism assays

Brivaracetam (BRV) is a new high affinity synaptic vesicle protein 2A ligand recently approved for adults with partial-onset seizures. As a support to in vitro metabolism assays, a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method coupled to off-line solid phase extraction (SPE) was developed to quantify BRV acid metabolites, that is, BRV-AC (carboxylic derivative derived from BRV hydrolysis) and BRV-OHAC (corresponding to hydroxylated BRV-AC). The method was validated for various incubates (liver and kidney tissue homogenates and blood, all from humans) and applied to in vitro metabolism assays. The analytes were isolated from buffered samples using ISOLUTE C8 96-well SPE plates. Chromatographic separation was achieved on a Waters Atlantis T3 C18 analytical column (2.1u202fmmu202f×u202f50u202fmm, 5u202fμm) with detection accomplished using a Waters Premier tandem mass spectrometer in positive ion electrospray and multiple reaction monitoring (MRM) mode. The standard curves, which ranged from 1.00 to 200u202fng/mL for BRV-AC, BRV-OHAC, were fitted to a 1/x2 weighted linear regression model. The intra-assay precision and inter-assay precision (expressed as coefficient of variation -%CV) were <8.5%, and the assay accuracy (deviation - %Dev) was within ±7.1% for the different matrices. This accurate, precise, and selective SPE/LC-MS/MS method has been successfully applied to in vitro assays aimed at characterizing the kinetics of BRV hydrolysis. BRV was found to be a better substrate for hydrolysis than its hydroxylated metabolite BRV-OH. BRV hydrolysis was detected in blood, liver and kidneys, demonstrating the broad distribution of the enzyme catalyzing the reaction.

Criblage toxicologique : comparaison de résultats obtenus par chromatographie en phase gazeuse–spectrométrie de masse (CG–SM)/par chromatographie liquide–spectrométrie UV à barrette de diodes–spectrométrie de masse (CL–UV/BD–SM) vs. chromatographie liquide–trappe ionique (CL–SMn)

Objectif nComparer les resultats obtenus en toxicologie hospitaliere entre deux approches de criblage systematique par CG–SM (urine)/CL–UV/BD–SM (plasma) et CL–SMn. nDescription nLa necessite d’elaborer des strategies generiques pour cribler et/ou quantifier de nombreux composes dans les laboratoires de toxicologie demeure un defi. Les matrices les plus courantes pour effectuer ces recherches sont le plasma et les urines. Le plasma presente l’avantage de refleter a un instant donne les xenobiotiques et leurs metabolites presents dans l’organisme. L’urine est une matrice non invasive, de collecte facile et obtenue avec un volume compatible avec une recherche de composes aux proprietes differentes. Nous nous interesserons aux premiers resultats de criblage obtenus sur des patients admis en reanimation medicale par deux strategies complementairesxa0: la CG–SM ou la CL–UV/BD–SM, methodes de reference et la CL–SMn (Toxtyper®). nMethodes nApres extraction sur support solide (SPE) off-line, les extraits plasmatiques ont ete analyses par CL–UV/BD–SM et par le Toxtyper®. Pour la CL–UV/BD–SM, l’identification repose sur l’association temps de retention–spectre UV–spectre MS. Le spectre UV des molecules est alors compare a une banque de spectres. La presence des ions (m/z) pseudomoleculaires obtenus par un detecteur simple quadripole apres electrospray positif/negatif confirme ou non la presence des xenobiotiques. A partir de l’urine, deux extractions en milieu acide et basique sont realisees. Apres une preparation d’echantillon par SPE et/ou extraction liquide-liquide (LLE) et evaporation de la phase organique, les extraits sont repris par du methanol et injectes. La CG–SM est un simple quadruple operant en mode scan. Chaque spectre est compare a une bibliotheque specifique. Pour la CL–SMn (Toxtyper®), l’identification repose sur le couple temps de retention–spectre SM (SM, SM/SM, SM3). Les resultats sont compares a une bibliotheque dediee (Bruker Toxtyper 2.0). nResultats nPour chaque patient admis en reanimation, un criblage toxicologique systematique est mis en œuvre dans le but d’obtenir un bilan analytique initial. Les resultats obtenus apres analyse d’une cinquantaine d’extraits plasmatiques et urinaires par le systeme Toxtyper® montrent une tres bonne concordance avec ceux obtenus en CL–UV/BD–SM et CG–SM. Les principales substances impliquees dans le tableau d’intoxication (benzodiazepines, cardiotoxiques, β-bloquants, antiepileptiques, amphetamines, opiaces, cathinones) et/ou administrees pendant la prise en charge (anesthesiques, vasoconstricteurs) sont retrouvees. nDiscussion et conclusion nAu laboratoire, une strategie couplant CL–UV/BD–SM est mise en œuvre qui permet de rendre des resultats plasmatiques aux services cliniques 24xa0h/24 7xa0j/7xa0en moins de 90xa0minutes. Pour l’urine, la technique de reference reste la CG–SM car il existe depuis de nombreuses annees des bases de donnees importantes. L’avenement de strategies CL–SM haute resolution est prometteuse mais encore couteuse. D’autres approches CL–SM couplant de la CL a une detection par spectrometrie de masse de type trappe ionique (Toxtyper®) operant en mode autoMSn demeurent interessante. Ce sont en effet des methodes rapides (<xa020xa0min), robustes et specifiques, tres bien adaptees au contexte d’urgence.

Corrélation des concentrations plasmatiques de diazépam, N-desméthyldiazépam et oxazépam par deux méthodes d’analyses (CL–UV/BD–SM et CL–SM/SM) dans un contexte de toxicologie clinique

Objectif Verifier que les resultats rendus dans un contexte d’urgence (CL–UV/BD–SM) sont bien correles aux resultats obtenus par la technique de reference (CL–SM/SM), et cela pour trois benzodiazepines courantesxa0: le diazepam, le nordiazepam et l’oxazepam. Description Les benzodiazepines sont les psychotropes les plus prescrits dans la prise en charge des troubles anxieux dans les pays occidentaux, et notamment en France. Souvent retrouvees dans les intoxications medicamenteuses, les cas de mono-intoxications engagent rarement le pronostic vital, a l’inverse des cas de poly-intoxications souvent plus graves. La detection plasmatique de ces molecules releve donc de l’urgence medicale, permettant ainsi une prise en charge clinique la plus rapide et efficace possible. Un screening toxicologique d’urgence (STU) est mis en œuvre pour chaque arrivee en reanimation dans le but d’obtenir un bilan analytique initial. Methodes Au laboratoire, le STU est realise et repose sur une separation par chromatographie liquide ultra-haute pression, suivie d’une double detection des molecules via un detecteur UV a barrette de diodes et spectrometrie de masse (CL–UV/BD–SM). Apres extraction sur support solide, 5xa0μL de l’eluat plasmatique est injecte et les molecules extraites sont separees par UPLC sur une colonne C18 (2,1xa0×xa0150xa0mm, 1,7xa0μm) et analysees par BD puis SM. Le spectre UV des molecules est etudie pour 3xa0longueurs d’ondes (210, 230, 260xa0nm) et compare a une banque de spectres. La presence des ions pseudomoleculaires obtenus en MS par un detecteur simple quadripole apres electronebulisation positive/negative (ESI–SM) confirme ou non la presence des xenobiotiques. Une methode de dosage dediee, developpee parallelement en chromatographie liquide couplee a la spectrometrie de masse en tandem (CL–SM/SM), est egalement realisee pour confirmer les resultats obtenus. Resultats Avec le STU, le diazepam et ses deux metabolites sont detectes et peuvent etre quantifies entre 0,02xa0et 5xa0mg/L pour toutes les molecules, a l’exception de l’oxazepam (seule presence/absence notifiee en rendu de resultats quotidiens). La repetabilite, precision et exactitude sont comprises entre −9,9xa0et 21,5xa0% pour les trois molecules. La reproductibilite est comprise entre −13,5xa0et 24,3xa0%. La correlation des resultats obtenus entre le STU et la methode dediee par CL–SM/SM faites a trois concentrations differentes (0,2, 0,5xa0et 1xa0mg/L) montrent une bonne correlation avec un coefficient de Pearson compris entre 0,79xa0et 1. Discussion et conclusion Le criblage toxicologique et les methodes analytiques dediees permettent d’identifier le diazepam et ses deux metabolites et d’evaluer leurs concentrations par rapport aux seuils therapeutiques et toxiques documentes dans la litterature. Le STU est une methode tres bien adaptee au contexte d’urgence. En effet, elle est rapide (

Intoxication à l’hydroxychloroquine : valeur prédictive de la concentration sanguine à l’admission et étude toxicocinétique

Objectif Les intoxications par hydroxychloroquine sont rares mais, comme celles a la chloroquine peuvent menacer le pronostic vital. La prise en charge est adaptee de celle de l’intoxication a la chloroquine, avec evaluation des facteurs pronostiques (dose ingeree, pression arterielle et largeur des QRS a l’ECG) et mise en route d’un traitement associant ventilation mecanique, adrenaline et diazepam si mauvais pronostic. La valeur predictive de la concentration ainsi que la toxicocinetique sanguine de l’hydroxychloroquine sont peu etudiees. Nous rapportons un cas d’intoxication grave ayant justifie la mise en place d’une ECMO veino-arterielle et discutons l’interet du dosage sanguin. Cas clinique Une patiente de 25xa0ans, sans antecedents, etait admise en reanimation pour ingestion de 6xa0g d’hydroxychloroquine, 560xa0mg d’omeprazole et 1,5xa0mg de l -thyroxine a but suicidaire. Au domicile, elle presentait un trouble de conscience (score de Glasgow a 10), une hypotension (76/49xa0mmHg) et un elargissement des QRS (0,110xa0s). Elle etait intubee, ventilee et recevait un remplissage (2,5xa0L de NaCl 0,9xa0%), adrenaline (0,5xa0mg/h) et diazepam (2xa0mg/kg bolus puis 2xa0mg/kg/j). A l’admission (H4xa0de l’ingestion), elle restait hypotendue avec une acidose lactique (pH a 7,25, lactates a 5,16xa0mM). Rapidement, elle developpait une defaillance renale et respiratoire, malgre la perfusion de 750xa0mL de NaHCO 3 8,4xa0% et l’augmentation des catecholamines (adrenaline 8xa0mg/hxa0+xa0dobutamine 20 γ/hxa0+xa0noradrenaline 25xa0mg/h). Une ECMO veino-arterielle etait mise en place au lit par abord chirurgical femoral pour choc refractaire a predominance cardiogenique (fraction d’ejection ventriculaire echographique de l’ordre de 10xa0%). Par la suite, le monitorage biquotidien de la fonction contractile cardiaque montrait une regression progressive de l’hypokinesie globale, permettant la decanulation a j7, avec recuperation ad integrum. Au cours du sejour, la patiente presentait une pneumonie acquise sous ventilation et une infection urinaire bacteriemique traitees par antibiotiques adaptes. L’extubation etait realisee a j23xa0et la sortie en psychiatrie a j30. Resultats Les concentrations sanguines d’hydroxychloroquine et de ses trois metabolites principaux, la monodesethylhydroxychloroquine, la desethylchloroquine et la bisdesethylchloroquine etaient determinees par LC-MS/MS (Quantum Ultra, Thermo, Etats-Unis), a 19xa0500, 1123, 109xa0et 91xa0ng/mL respectivement, a H4xa0de l’ingestion. Un modele bi-compartimental permettait de calculer des demi-vies d’elimination observees de 9,1, 8,4, 12,6xa0et 21,0xa0h pour chacune des molecules (ADAPT5). L’analyse de six autres cas d’intoxication admis dans notre service en 10xa0ans retrouvait une bonne valeur predictive de la concentration d’hydoxychloroquine sur sang total a l’admission en reanimationxa0: pas de complications (cas avec concentration initiale a 2016xa0ng/mL), effet stabilisant de membrane modere a l’ECG (5410xa0et 6451xa0ng/mL), effet stabilisant important, syndrome de Brugada electrique et choc cardiogenique (11xa0760xa0ng/mL), choc refractaire justifiant la pose d’une ECMO (19xa0500xa0ng/mL) et deces par defaillance multiviscerale malgre l’ECMO (29xa0306xa0ng/mL). Conclusion L’intoxication a l’hydroxychloroquine peut etre responsable de troubles cardiovasculaires gravissimes. En cas de choc cardiogenique, l’ECMO pourrait etre le seul recours pour permettre la survie. La concentration dans le sang d’hydroxychloroquine a l’admission a une bonne valeur predictive et peut completer de facon utile les facteurs pronostiques cliniques valides pour la chloroquine.

Intoxication à l’amlodipine avec choc réfractaire : rôle respectif de l’ECMO, du bleu de méthylène, des intralipides et du MARS©, basé sur une étude toxicocinétique

Objectif Les intoxications aux inhibiteurs calciques representent la 1 re cause de mortalite par cardiotoxiques. L’assistance circulatoire semble un traitement prometteur en cas de choc cardiogenique refractaire aux traitements pharmacologiques, mais aucun traitement n’a a ce jour demontre sa reelle efficacite pour les chocs vasoplegiques refractaires aux catecholamines. L’interet du systeme d’epuration MARS

P55: Tableau clinique d’une ingestion de colchicine illustré par un suivi toxicocinétique

Introduction Les intoxications a la colchicine sont relativement rares. La severite de l’intoxication et la mortalite sont directement liees a la dose ingeree. Nous rapportons une observation clinique typique d’une ingestion massive de colchicine illustree d’un suivi toxicocinetique prolonge. Cas clinique Un homme de 61 ans ingere 43xa0mg de colchicine (0,7xa0mg/kg) ; malgre une prise en charge initiale adaptee, il va presenter une defaillance multiviscerale associant une atteinte respiratoire (SDRA), hemodynamique (choc cardiogenique et vasoplegique, dysfonction ventriculaire gauche a l’echocardiographie), digestive (diarrhee et vomissements), hepatique (cytolyse hepatique sur rhabdomyolyse), renale (insuffisance renale anurique), hematologique (CIVD initiale puis survenue au 3 e jour d’une aplasie avec neutropenie febrile et thrombopenie) et dermatologique (alopecie). Il va presenter secondairement des complications iatrogenes de sa prise en charge therapeutique : necrose seche de l’avant pied droit et des orteils du pied gauche en rapport avec les fortes doses de catecholamines administrees et une tetraparesie predominant aux membres superieurs. Methode La recherche des toxiques « habituels » est revenue negative dans le sang et les urines. Des dosages specifiques et reiteres de la colchicine dans le sang ont permis un suivi toxicocinetique. Pour evaluer les concentrations plasmatiques de colchicine, une methode de dosage a ete developpee et validee en LC-MS/MS. Brievement, 200xa0μL de serum sont melanges avec 20xa0μL de colchicine- D3 et 100xa0μL de sulfate de zinc 0,14xa0mol/L. Apres agitation au vortex, le melange est centrifuge, puis 30xa0μL de surnageant sont injectes dans un systeme HPLC Aria TLX-1 (Thermo Scientific) sur une colonne Cyclone P (50xa0×xa00,5xa0mm). Apres transfert, la separation est realisee sur une colonne Hypersil Gold 50xa0×xa02,1xa0mm 2.1μm a l’aide d’un gradient basse pression eau/methanol acidifie avec 0,1 % d’acide formique a un debit de 0,6xa0mL/min. La detection par spectrometrie de masse est realisee sur un triple quadripole TSQ Quantum Ultra (Thermo Scientific). Les transitions utilisees sont les suivantes : m/z 400,3 → 358,1 pour l’identification et la quantification de la colchicine, m/z 400,3 → 310.1 pour sa confirmation et m/z 403.2 → 359.2 pour la colchicine-D3. Table Abstract P55. Colchicine H10 J1 J2 J2.5 J3 J4 J5 J6 J7 J14 nmol/l 41.30 13.65 15.80 14.80 11.40 10.20 10.75 14.50 12.00 2.00 Discussion La colchicine est un alcaloide de la famille des poisons du fuseau. Ses principales indications sont l’acces de goutte, la prophylaxie des acces aigus de goutte, la pericardite, la maladie de Behcet et la maladie periodique. Dans notre observation, le patient a presente une symptomatologie typique et complete d’un surdosage par la colchicine en 3 temps: troubles digestifs initiaux associes a une CIVD puis secondairement installation entre le 2 e et le 4 e jour de la defaillance multiviscerale et pour finir l’apparition de l’alopecie alors que l’atteinte medullaire regresse. Le diagnostic positif repose sur les dosages de la colchicine dans le sang. Ces dosages ne sont pas necessairement faits en urgence car il n’existe pas de correlation entre la concentration plasmatique a l’admission et le pronostic. Conclusion L’intoxication a la colchicine reste une intoxication rare mais severe. Le traitement est purement symptomatique en l’absence d’antidote efficace. Des prelevements a visee conservatoire permettent de confirmer l’intoxication.

P57: Acute ivabradine intoxication management in a critical care unit: Need for constant interaction between biological and clinical wards to follow new drug intoxication cases

Introduction A 19-year-old female, with a past medical history of borderline personality with multiple suicide attempts, and currently treated with ivabradine, bisoprolol, amitriptyline and oxcarbazepine, voluntarily ingested 28 pills of ivabradine (Procoralan ® , 7.5mg) during a consultation with her psychiatrist. The emergency medical services were alerted by the psychiatric hospital staff, after the patient started to be bradycardic at 36 beats per minutes, and arrived 75 minutes after ingestion. At first examination the patient was found bradycardic with conserved hemodynamics (blood pressure 94/58xa0mmHg) and no evidence of shock, and an otherwise normal clinical examination. The patient was admitted in Critical Care 2.5 hours after ingestion. Upon arrival urine and blood were sampled and sent to the toxicological laboratory for further analyses. Toxicological Analyses Blood and urine toxicological screenings were not able to detect any drugs. A complementary GC-MS urinary screening enabled to detect patients medication (oxcarbazepine, amitryptiline metabolite) as well as atropine. Ivabradine being ingested without any doubt, an assay was developed to monitor concentration of ivabradine and its major metabolite in plasma and urine, coupling liquid chromatography to mass spectrometry (LCMS/ MS). LC separation was achieved on a 50xa0×xa03mm 3xa0μm Hypersil Gold analytical column using a gradient mode. MS detection was performed in positive electrospray on a Quantum Ultra triple-quadrupole (Thermo, USA) in Multiple Reaction Monitoring (MRM) mode. Analytes co-eluted at 3.3xa0min with a total analysis time of 11.5xa0min. Results After a rapid method development and partial validation that fulfilled bioanalytical validation parameters criteria, ivabradine and its metabolite were quantified in plasma and urine samples by LC-MS/MS. For both analytes, a linear response was obtained between 2.5 and 500xa0ng/mL. At admission, concentration of ivabradine and its metabolite in patients plasma were of 119.2 and 78.9xa0μng/mL respectively, which confirmed the intoxication. Ivabradine was rapidly eliminated from the body, as its plasma level was undetectable 11.5 hours after ingestion. Decrease of plasma concentration was slightly slower for the metabolite which was found at 3.8μng/mL 23.5 hours after ingestion. Discussion and conclusion Untargeted screening could be limited for identifying drugs unregistered in library database, thus targeted assays such as LC-MS/MS are relevant for answering clinicians needs. Ivabradine and its metabolite were quantified by LC-MS/MS 3.5 hours after ingestion of 210xa0mg of Procoralan ® , and during 21 hours following intoxication. For the authors, it is the first case of acute intoxication of this new specific bradycardic agent proposed as an alternative medication to beta-blockers. The patient answered well to isoprenaline which was administered approximately 7 hours after ingestion. Drugs levels decreased rapidly and werecorrelated to the lack of any other secondary effect, enabling a transfer to the psychiatric ward 48 hours after admission. This example clearly illustrates the need for continuous dialog between laboratory and clinical wards to match new drugs intoxication cases, which would improve therapeutic management of patients in Medical Care unit.