Florence Depontieu

Endocan Expression and Relationship with Survival in Human Non–Small Cell Lung Cancer

Purpose: We evaluated the expression of endocan, a soluble lung- and kidney-selective endothelial cell-specific dermatan sulfate proteoglycan, in non–small cell lung tumors compared with normal lung and studied the significance of high levels of circulating endocan in patients with non–small cell lung cancer. Material and Methods: Endocan and vascular endothelial growth factor mRNA expression were evaluated by semiquantitative PCR in tumoral and nontumoral lung tissue samples from a first series of 24 patients submitted to curative surgery. Relationships between survival, time to tumor progression, and serum levels of endocan were evaluated in a second series of 30 previously untreated patients addressed for staging. Results: In non–small cell lung cancers, endocan mRNA was overexpressed compared with control lung. Immunohistochemistry shows that endocan was expressed only by tumor endothelium in all cases, especially in the periphery of the tumors, with no differences between adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. Endocan and vascular endothelial growth factor mRNA expression was positively correlated in lung tumors. Serum endocan levels, as well as tumor, node, and metastasis status, were correlated with both survival and time to tumor progression. However, endocan serum level was not an independent prognostic factor due to its correlation with the presence of metastasis. Conclusion: Endocan is overexpressed in non–small cell lung tumors compared with healthy lung and probably represents a response of tumoral endothelium to proangiogenic growth factor stimulation. Circulating levels of endocan might reflect tumor angiogenic stimulation and present prognostic significance.

Calpain inhibitors improve myocardial dysfunction and inflammation induced by endotoxin in rats.

Excessive activation of calpains has been implicated in the pathophysiology of inflammation, trauma, and ischemia reperfusion injury. Here, we investigated the effects of calpain inhibition on myocardial dysfunction and inflammation induced by endotoxin in rats. Rats were treated i.v. with endotoxin (10 mg/kg) or endotoxin plus calpain inhibitors and were then prepared after 4 h for myocardial contractility assessment, detection of endothelium leukocyte interactions, and plasma TNF-α, nitrite/nitrate, and endocan levels. Compared with vehicle-treated rats, hearts from endotoxin-treated rats had reduced systolic performance that was partially prevented by calpain inhibitors, i.e., acetyl-leucyl-leucyl-arginal (leupeptin), carbobenzoxy-valyl-phenylalanial (calpain inhibitor III), and N-acetyl-leucinyl-leucinyl-norleucinal (ALLN). Leupeptin and calpain inhibitor III reduced plasma TNF-α levels in endotoxin-treated rats. ALLN reduced plasma TNF-α and nitrite/nitrate levels in endotoxin-treated rats. Endotoxin treatment increased mesenteric venule leukocyte rolling (10 ± 3 leukocytes/min vs. 44 ± 10 leukocytes/min; P < 0.01) and adhesion (2 ± 2 leukocytes/min vs. 15 ± 3 leukocytes/min; P < 0.01), which was reduced by calpain inhibitors. Attenuation of leukocyte endothelium interactions observed in calpain inhibitor-treated rats with sepsis was associated with increases in plasma anti-adhesion molecule endocan. In conclusion, calpain inhibitors improved endotoxin-induced cardiac dysfunction, which may be attributed to the modulation of endothelium leukocyte interactions in the inflamed vasculature.

Loss of Endocan tumorigenic properties after alternative splicing of exon 2.

BackgroundEndocan was originally described as a dermatan sulfate proteoglycan found freely circulating in the blood. Endocan expression confers tumorigenic properties to epithelial cell lines or accelerate the growth of already tumorigenic cells. This molecule is the product of a single gene composed of 3 exons. Previous data showed that endocan mRNA is subject to alternative splicing with possible generation of two protein products. In the present study we identified, and functionally characterized, the alternative spliced product of the endocan gene: the exon 2-deleted endocan, called endocanΔ2.MethodsStable, endocanΔ2-overexpressing cell lines were generated to investigate the biological activities of this new alternatively spliced product of endocan gene. Tumorigenesis was studied by inoculating endocan and endocanΔ2 expressing cell lines subcutaneously in SCID mice. Biochemical properties of endocan and endocanΔ2 were studied after production of recombinant proteins in various cell lines of human and murine origin.ResultsOur results showed that the exon 2 deletion impairs synthesis of the glycan chain, known to be involved in the pro-tumoral effect of endocan. EndocanΔ2 did not promote tumor formation by 293 cells implanted in the skin of severe combined immunodeficient (SCID) mice.ConclusionOur results emphasize the key role of the polypeptide sequence encoded by the exon 2 of endocan gene in tumorigenesis, and suggest that this sequence could be a target for future therapies against cancer.

Development of monoclonal antibodies and ELISA specific for the mouse vascular endocan.

Human vascular endocan is a proteoglycan exhibiting tumorigenic activity through both its glycan and protein cores. Endocan mRNA is identified as being one of the most significant molecular signatures defining a poor prognosis in lung, breast, kidney, prostate, and thyroid malignancies. The survival inversely correlates with endocan expression in tumor tissue from hepatocarcinoma, and in serum from lung cancer. In mouse, endocan mRNA is also increased in tumor vessels. However, mouse endocan has not yet been fully characterized. Here, we produced a panel of rat monoclonal antibodies directed against mouse endocan, leading to the development of a specific mouse/rat endocan ELISA. Mouse endocan serum level was measured at a median of 0.96 ng/mL and 1.08 ng/mL in 129Sv mice and C57bl6, respectively. These results also provide new tools to characterize and explore the role of endocan in mouse and rat models of human diseases. These results present mouse vascular endocan as a circulating molecule similar to human endocan.

Identification of cathepsin G in the generation of elastase-resistant fragment of vascular endocan: involvement in the regulation of LFA-1-dependent cascade

The migration of polymorphonuclear neutrophils (PMN) into inflamed tissue requires fine interactions with the endothelial cell surface. The PMN serine proteases cathepsin G (CG), neutrophil elastase (NE) and proteinase 3 (PR3) were originally thought to play a role by the cleavage of endothelial cell proteins that control the PMN firm adhesion and the transendothelial cell migration. However, how these proteases participate in leukocyte adhesion and transmigration remains controversial. Vascular endocan, also called esm1, is a restricted endothelial cell-secreted proteoglycan constituted by a protein core of 20 kDa and by a unique glycosaminoglycan chain of dermatan sulphate (DS). Endocan is preferentially expressed in lung and kidney tissues. Endocan binds to its leukocytic receptor, the LFA-1 integrin, with an affinity of 18 nM, and inhibits the LFA-1-ICAM-1 interactions. Its expression is upregulated by the proinflammatory mediators TNF, IL-1, and lipopolysaccharide (LPS). In human sepsis, the serum endocan increases from fivefold to 30-fold the normal value and correlates with bad prognosis. Here, we examined the role of PMN-derived proteases in the degradation of endocan.

051 L’exon 2 du gène d’Endocan contribue à sa tumorigénicité et son expression est augmentée au cours de cancers bronchiques humains

Introduction Endocan est un proteoglycane, de type chondroitine/dermatane sulfate, secrete specifiquement par la cellule endotheliale, preferentiellement pulmonaire et renale. Chez la souris immunodeficiente, endocan promeut la croissance de la lignee cellulaire non spontanement tumorigene 293-HEK, tandis que le mutant non glycosyle est incapable de promouvoir cette croissance. Des etudes par microarray ont montre que l’ARNm d’endocan etait un des marqueurs definissant un mauvais pronostic dans les cancers du poumon, de la prostate, du sein et du rein. Le gene ESM-1, clone dans le laboratoire est transcrit en 2 ARNm issus d’un epissage alternatif: endocan, la forme majoritaire avec les 3 exons, et endocan Δ 2, delete de l’exon 2. Methodes Un modele experimental de tumeurs est realise par injection sous-cutanee de 10 293-HEK transfectes par Endocan vs. Endocan Δ 2. Des pieces chirurgicales dans le cadre du CCPPRB n° CP 03/93, issues de patients atteints de cancers bronchiques non a petites cellules sont analysees par RT-PCR et immunohistologie. Resultats Endocan Δ 2 est un proteoglycane de type chondroitine/dermatane sulfate de glycosylation dite facultative: 60 % de la molecule secretee est glycosyle tandis que 40 % est secrete sous une forme non glycosylee (polypeptide seul). Endocan Δ 2 est incapable de promouvoir la croissance tumorale de la lignee 293-HEK, contrairement a endocan. Au cours de cancers bronchiques chez l’homme, tandis que l’expression d’endocan Δ 2 n’est pas modifiee, celle d’endocan est augmentee tant au niveau de l’ARNm que de la proteine. Conclusion Au cours de cancers bronchiques chez l’homme, seule la forme tumorigene endocan est surexprimee. Cette augmentation au niveau des neovaisseaux tumoraux pourrait expliquer la surexpression d’endocan dans le sang des patients atteints de cancers bronchiques. La difference entre les deux isoformes suggere que la sequence derivee de l’exon 2 pourrait etre une cible therapeutique interessante dans les cancers bronchiques.

012 Étude du catabolisme d’endocan : rôle des protéases du polynucléaire neutrophile

Introduction Endocan est un proteoglycane secrete specifiquement par la cellule endotheliale pulmonaire. Il est detecte au niveau serique chez des individus sains et retrouve surexprime chez des patients atteints de sepsis ou de cancer bronchique. En plus d’etre correlee au mauvais pronostic de ces deux maladies, la surexpression d’endocan est impliquee dans leur physiopathologie. Ainsi, pour pouvoir explorer endocan comme cible therapeutique potentielle, il apparait interessant de controler son expression, notamment en jouant sur son catabolisme. Cependant, le mecanisme de degradation d’endocan est encore a ce jour totalement inconnu. Endocan etant retrouve pour l’essentiel dans le sang, interagissant avec les leucocytes, nous nous sommes orientes sur l’etude de la degradation d’endocan par les leucocytes et plus precisement par les polynucleaires neutrophiles (PNNs). Methodes Des PNNs sont isoles a partir de poches de sang et resuspendus dans un milieu HBSS a 10 6 cellules/ml pour etre stimules par 10 nM de Phorbol Myristate Acetate, pendant 3 heures a 37°C. Le surnageant de PNNs, contenant les proteines secretees, est ensuite recueilli et teste pour son activite de degradation vis-a-vis d’endocan en le mettant en contact avec de l’endocan recombinant pendant 2 a 72 heures a 37 °C. La degradation d’endocan est ensuite evaluee par dosage ELISA et visualisee par Western blot. L’activite proteasique du surnageant de PNNs sur endocan est determinee par utilisation d’un cocktail inhibiteur de proteases. Resultats Les resultats montrent que les PNNs secretent des proteases clivant endocan en differents sites. Si l’extremite N-termi-nale d’endocan n’est pas degradee, les proteases coupent le corps proteique entre les acides amines 107 et 136 pour former des fragments de 15 et 14 kDa, et entre les acides amines 81 et 106 pour donner un peptide de 10 kDa. Un point important concerne le fragment de 14 kDa, qui constitue le metabolite majoritaire. Les donnees cinetiques montrent qu’il apparait tres precocement et persiste au moins pendant 3 jours en presence de proteases neutrophiles. Conclusion On peut penser qu’au cours d’etats infectieux severes, les PNNs actives sont capables de degrader plus rapidement endocan et modifient ainsi les activites biologiques de cette molecule.

050 Rôle d’Endocan dans un modèle de métastases pulmonaires de mélanome chez la souris

Introduction Endocan est un proteoglycane secrete sous forme soluble par les cellules endotheliales pulmonaires. Son role protumoral a ete mis en evidence dans un modele de xenogreffe de tumeur humaine chez la souris immunodeprimee (SCID). De facon parallele, endocan est surexprime dans les tumeurs humaines, en terme d’ARNm et de proteines. Endocan interviendrait de facon indirecte, en jouant sur l’environnement tumoral. Il peut lier des facteurs de croissance, comme le HGF/SF, via son glycane. De plus, il interagit avec LFA-1 via la partie proteique et empeche sa liaison a ICAM-1, ce qui laisse supposer un role dans la migration transendotheliale des leucocytes. Enfin, le blocage d’endocan ralentit la croissance tumorale dans un modele de xenogreffe de tumeur humaine chez la souris SCID, et provoque des modifications stromales, avec notamment un infiltrat panleucocytaire. Ces donnees suggerent qu’endocan pourrait jouer un role dans l’immunite antitumorale. L’objectif du travail est d’apprehender les interactions entre le systeme immunitaire et endocan, en etudiant l’effet du blocage d’endocan murin endogene dans un modele syngenique de metastases pulmonaires de melanome chez la souris immunocom-petente C57BL/6. Modele 10 5 cellules Bl 6F10 ont ete injectees dans la veine de la queue de la souris. L’injection d’anticorps monoclonaux anti-endocan debute a J3, en intraperitoneal, puis est repetee de facon hebdomadaire. Les souris sont euthanasiees a J32, et le nombre de metastases pulmonaires est compte. Des prelevements sont realises pour analyse histologique et extraction d’ARNm. Resultats Les taux seriques d’endocan augmentent lors du developpement des metastases pulmonaires. Le blocage d’endocan murin a un effet on-off sur l’apparition des metastases pulmonaires. Sur le plan microscopique, il existe des modifications du stroma tumoral avec des specificites selon l’anticorps utilise : modification de l’architecture tumorale, presence de plages d’œdeme, modification de l’aspect des noyaux, et presence d’infiltrats de cellules mononucleees. Conclusions L’expression d’endocan augmente lors du developpement des metastases pulmonaires de melanome murin, comme chez des patients presentant des tumeurs bronchopulmonaires. De plus les anticorps anti-endocan ont un effet sur l’apparition des metastases pulmonaires. Ces resultats suggerent qu’endocan est une cible interessante de l’environnement tumoral.

042 Rôle d’endocan murin dans la croissance des xénogreffes tumorales HT29 chez la souris SCID Comparaison avec les tumeurs humaines

Introduction Endocan est un dermatane sulfate proteoglycane exprime specifiquement par la cellule endotheliale. La surexpression d’endocan par les cellules epitheliales augmente leur potentiel tumorigene. Nous avons etudie le role d’endocan murin dans la croissance des xenogreffes tumorales et son expression dans un panel de tumeurs humaines. Materiel et methode Nous avons utilise un modele de xenogreffe tumorale avec des cellules HT29 (2,5 x 10 5 cel/animal) en sous-cutane chez la souris SCID. Les souris recoivent un anticorps monoclonal anti-endocan murin (400 μg/semaine) apres l’injection des cellules tumorale. L’expression d’endocan murin au niveau tumoral est etudie par PCR et immunohistochimie. Nous avons parallelement etudie un panel de 22 cancers pulmonaires. Resultats Chez l’animal, l’injection de cellules HT29 genere systematiquement des tumeurs. Ces tumeurs ont une croissance rapide, imposant le sacrifice des animaux apres 5 a 6 semaines en raison de la taille tumorale. Dans ces tumeurs on retrouve une expression intense d’endocan tant en ARNm qu’en proteine. Le traitement par l’anticorps anti-endocan reduit de moitie le volume et le poids des tumeurs. Les animaux ayant recu un traitement ont un stroma tumoral et une infiltration leucocytaire plus importants. Dans les tumeurs bronchiques, en immunohistochimie et en PCR, on retrouve une surexpression d’endocan au niveau tumoral compare au tissu a distance de la tumeur et ce dans toutes les tumeurs etudiees. Il existe chez ces patients une elevation des taux seriques d’endocan. La survie des patients ayant des taux seriques d’endocan plus eleves (> 1.3 ng/ml) est plus courte (9 mois de mediane) par rapport au patient ayant des taux plus bas (30 mois de mediane). Conclusion Endocan joue un role dans la croissance des xenogreffes tumorales. Il est surexprime au niveau de l’endothelium tumoral tant dans les xenogreffes que dans les tumeurs humaines. Les anticorps anti-endocan reduisent la croissance tumorale. Cet effet est associe a une infiltration leucocytaire au niveau tumoral. Les taux seriques d’endocan pourraient avoir une valeur pronostique dans les cancers broncho-pulmonaires.