Gabriele Trummer

The effect of sample treatment on separation profiles of tear fluid proteins: Qualitative and semi-quantitative protein determination by an automated analysis system

Abstract Purpose. Qualitative and quantitative determination of tear fluid components is of increasing interest in ophthalmology. Until now, for diagnosis and course control of some diseases of the anterior parts of the eye, different methods for tear fluid protein analysis are available. Results can be obtained by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), immunochemistry, and high-performance liquid chromatography (HPLC). A new method for protein separation, identification and semi-quantitative determination on a chip-based micro-fluidic technique is used for the first time to investigate tear fluids. Methods. Normal human reflex tears were obtained by stimulation with China mint oil and collected using glass capillary tubes. A lab-on-a-chip technology (developed by Agilent Technologies, Waldbronn, Germany, in co-operation with Caliper Technologies, Mountain View, California, USA) was used for separation and semi-quantitative determination of tear proteins. Tear fluid was separated on the Agilent 2100 Bioanalyzer in combination with the Protein 200 LabChip kit and the dedicated protein assay software. Time and temperature of the incubation with sample buffer were varied, and the influence of these parameters on protein separation profiles was studied. Tear proteins were also analysed by PAGE, and the results obtained by both methods were compared. Results. The different proteins of tear fluid can be separated by the Agilent 2100 Bioanalyzer method in very short time. By this method, the molecular weight as well as the concentration of proteins can be determined. Data are automatically stored in digital format and can be retrieved and shared. Results of this technology were comparable with the protein pattern obtained by PAGE. It was confirmed by both methods that, depending on incubation time of tear fluid with sample buffer and on temperature, different protein pattern can be obtained from the tears of one specimen. Conclusion. Tear proteins – in contrast to serum or aqueous humour proteins – are very sensitive to changes in sample buffer temperature as well as incubation time with buffer. To obtain comparable results for tear fluid proteins, the sample buffer applied and the incubation time and temperature must be observed carefully. This can be demonstrated by both the new Agilent 2100 Bioanalyzer method and PAGE. These results are of importance when comparing tear fluid protein pattern for the diagnosis and course control of dry-eye syndrome and of other diseases of the anterior part of the eye.

Cytotoxicity Evaluation of Soft Contact Lens Care Solutions on Human Conjunctival Fibroblasts

Purpose: To determine whether different contact lens care solutions for soft lenses cause damage to human conjunctival cells. Methods: Primary cultured human conjunctival fibroblasts were incubated with various concentrations of four different commercially available soft contact lens care solutions (OptiFree®, Renu®, SoloCare®, Titmus®) at concentrations of 5, 10 and 50 µl/ml medium. Toxicity was examined by determination of (1) the cell viability and mitochondrial activity with the colorimetric MTT test, and (2) the number of living cells with a cell analysis system (CASY 1) as compared with untreated cells. Results: For all four soft contact lens care solutions at a concentration of 5 µl/ml medium, no significant decrease in mitochondrial activity of the human conjunctival fibroblasts was found by the MTT test. At 10 µl/ml, only OptiFree and Titmus reduced mitochondrial viability significantly. The greatest reduction in mitochondrial activity occurred with all of the four soft contact lens care solutions at a concentration of 50 µl/ml. No significant decrease in the number of living conjunctival fibroblasts was observed by CASY 1 even at higher concentrations of the four solutions investigated. Conclusion: This in vitro study demonstrates that the examined soft contact lens care solutions induce changes in mitochondria of human conjunctival cells only at higher doses as observed by the MTT test. However, this damage to the mitochondria did not lead to cell death as shown by the cell analysis system.

Iodid schützt Bindehautzellen vor der Schädigung durch UV-Licht

ZusammenfassungUltraviolette Strahlung ruft an Zellen des vorderen Augenabschnitts Schäden hervor, die mit Fotokeratitis, Carcinomata in situ der Bindehaut, Basaliomen an den Lidern, Melanomen des vorderen Augenabschnitts, dem Entstehen des Pterygiums und Pingueculae in Verbindung gebracht werden.Ein signifikanter, schützender Effekt durch Iodid gegen die Schädigung von Bindehautzellen durch UV-Licht wurde mit einem Zellanalysesystem (CASY-System) nachgewiesen.Eine Anreicherung von Iodid im äußeren Auge, die durch Balneotherapie und Ophthalmoiontophorese mit Iodsole in Bad Hall (Oberösterreich) erreicht wird, könnte einen Schutz des Auges gegen energiereiche Strahlung bewirken.SummaryUltraviolet (UV) radiation provokes damages of cells of the anterior parts of the eye which may be associated with photokeratitis, carcinomata in situ of the conjunctiva, basaliomas of the lids, melanomas of the anterior part of the eye, and the development of pterygia and pingueculae.A significant protective effect of iodide against the damage by UV-light of conjunctival cells was determined using a cell analysis system (CASY-system).Enrichment of iodide in the anterior parts of the eye, as obtained by balneotherapy or iontophoresis with iodine brine in Bad Hall (Upper Austria) may provide protection of the eye against high-energy radiation.

Quantification of the cytotoxic effect of UV radiation on conjunctival and corneal cells by the CASY (cell analysis) system: an alternative to studies on animals

SummaryBackground: By depletion of stratospheric ozone, enhanced levels of UV radiation reach the surface of the earth. Exposure of the anterior parts of the eye to UV radiation leads to irritation of the conjunctival and corneal cells. Method: By the CASY (cell analysis) system the influence of UV radiation on cultures of conjunctival and corneal cells was observed by determination of the cell counts, cell diameter, and the cell volume. Results: By comparing these parameters with the control, damage of the conjunctival and corneal cells by UV radiation can be determined within 2 s of exposure of the cells in quartz glass vials to the UV light. Conclusion: By the CASY system the dramatic influence of UV radiation on cells of the anterior parts of the eye can be determined. This system enables objective statements on the cytotoxicity of radiation, chemical substances and drugs on cell cultures without the use of radioactive methods, complicated determination of cell metabolism or staining methods which are difficult to standardize. Also, studies on animals can be reduced by the CASY system.ZusammenfassungFragestellung: Durch die umweltbedingte Verringerung der Ozonkonzentration in der Stratosphäre gelangt verstärkt UV-Strahlung auf die Erdoberfläche. Sind die vorderen Augenabschnitte dieser UV-Strahlung ausgesetzt, kommt es zu Veränderungen von Bindehaut- und Hornhautzellen. Methode: Mit dem CASY (Zell-Analyse)-System kann der Einfluß der UV-Strahlung auf Bindehaut- und Hornhautzellen durch Bestimmung der Zellzahl, des Zelldurchmessers und des Zellvolumens gemessen werden. Ergebnisse: Vergleicht man diese Parameter mit denen der Kontrollzellen, kann eine Schädigung der Bindehaut- und Hornhautzellen bereits nach einer Bestrahlung von zwei Sekunden quantifiziert werden. Schlußfolgerung: Mit dem CASY-System kann der schädigende Einfluß der UV-Strahlen auf Zellen des vorderen Augenabschnitts bestimmt werden. Dieses System ermöglicht objektive Aussagen über die Zytotoxizität von Strahlung, von chemischen Substanzen oder Medikamenten auf Zellkulturen. Messungen mit radioaktiven Substanzen, die umständliche Bestimmung des Zellmetabolismus oder schwierig zu standardisierende Färbemethoden können somit vermieden werden. Das Zell-Analyse-System kann dazu dienen, die Anzahl von Tierversuchen zu reduzieren.

Der Einfluss von Iodid auf die Proliferation humaner Bindehautfibroblasten

ZusammenfassungDurch Iontophorese mit Iodsole bei einer Kurbehandlung in Bad Hall (Oberösterreich) kommt es zu einer Speicherung von Iodid in den Augengeweben. Um den Einfluss von Iodid auf menschliche Bindehautzellen zu untersuchen, wurden Primärkulturen humaner Bindehautfibroblasten angelegt und dem Kulturmedium Kaliumiodid in den Konzentrationen 0.6 mM, 3.0 mM und 6.0 mM zugesetzt und mit einer Kontrolle ohne Iodidzusatz verglichen. Nach 72 bzw. 96 Stunden wurde mit einem CASY-Zellanalysesystem festgestellt, dass sich die Zellzahl unter dem Einfluss von Iodid vermehrt. Im Vergleich zur Kontrolle vermehren sich die Bindehautzellen bei einer Konzentration von 0.6 mM KI nach 72 Stunden um 2.4 ± 0.28% und nach 96 Stunden um 0.7 ± 0.2%. Bei einem Zusatz von 3.0 mM KI kommt es zu einer Vermehrung der Zellzahl um 7.0 ± 1.0% nach 72 Stunden und um 4.3 ± 0.4% nach 96 Stunden. Die Konzentration von 6.0 mM KI vermehrt die Zellen nach 72 Stunden um 6.0 ± 1.2% und nach 96 Stunden um 5.5 ± 0.8%. Diese signifikante Zunahme der Zahl der menschlichen Bindehautfibroblasten in Zellkultur unter Iodidzusatz kann als Hinweis dafür gewertet werden, dass Iodid einen günstigen Einfluss auf die Proliferation von Bindehautzellen besitzt.SummaryIontophoresis with iodide brine during an eyecure treatment in Bad Hall (Upper Austria) leads to an accumulation of iodide in eye tissues. To investigate the influence of iodide on human conjunctival cells, primary cultures of human conjunctival fibroblasts were cultivated with addition of different concentrations i. e. 0.6 mM, 3.0 mM and 6.0 mM potassium-iodide (KI) and compared with a control without iodide addition. After 72 and 96 hours, respectively, the cell-count was increased under the influence of iodide as measured by a CASY-cell analysis system. Addition of 0.6 mM KI leads to an increase of the cell number by 2.4 ± 0.28% and 0.7 ± 0.2% after 72 and 96 hours, respectively, as compared to the control. Concentrations of 3.0 mM KI increase the cell number by 7.0 ± 1.0% and 4.3 ± 0.4%, and 6.0 mM KI by 6.0 ± 1.2% and 5.5 ± 0.8% after 72 and 96 hours, respectively. This iodide mediated significant increase of the number of cultivated human conjunctival fibroblasts may by indicative of a beneficial influence of iodide on the proliferation of conjunctival cells.

Zur Methodik der Polyacrylamidgel-Elektrophorese von Tränenproteinen

ZusammenfassungZur Diagnostik des trockenen Auges werden neben Schirmer-Test, Tränenfilmaufreißzeit, Bengalrosafärbung und Impressionszytologie immer häufiger auch Methoden angewendet, die zur Analyse der Träneninhaltsstoffe dienen. Die Proteine der Tränen werden oft mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) qualitativ und quantitativ bestimmt. Im Gegensatz zur Analyse der Proteine von Kammerwasser, Serum und anderen Körperflüssigkeiten werden tränenspezifische Lipocaline je nach Elektrophoresebedingungen verändert. Es wird gezeigt, dass bei der PAGE der Tränenproteine die Inkubationsdauer mit Probenpuffer, die Temperatur und die Anwesenheit reduzierender Substanzen eine Rolle spielen. Dadurch sind qualitative und quantitative Aussagen mit dieser Methode nur unter Anwendung genau definierter Bedingungen möglich.SummaryFor the diagnosis of dry eye, besides the Schirmer test, the tear film break-up time, rose bengal staining, and impression cytology increasingly methods for the analysis of tear components are used. Qualitative und quantitative determination of tear fluid proteins can be obtained by polyacrylamidegel-electrophoresis (PAGE). In contrast to the analysis of the proteins of aqueous humor, serum, and other human body fluids, the tear specific lipocalins undergo molecular changes according to the electrophoretic conditions applied. It is shown that duration of incubation with sample buffer, temperature and the presence of reducing substances are of importance to obtain comparable electrophoresis spectra. Therefore, qualitative and quantitative results of tear protein polyacrylamidegel-electrophoresis can only be obtained using definite conditions.

Abnahme der Mitochondrienaktivität menschlicher Bindehautzellen nach Säure- und Laugenverätzung

ZusammenfassungEinleitungBei Verätzungen des Auges durch Säuren oder Laugen können auch Bindehautzellen geschädigt werden. Hier wird eine Methode beschrieben, mit der die Mitochondrienaktivität humaner Bindehautzellen gemessen werden kann. Damit ist es möglich, das Ausmaß der Schädigung der Bindehautzellen nach Verätzung festzustellen.MethodeHumane Bindehautzellen (Chang-Zellen) werden kultiviert und mit Säure (0,02 M; 0,05 M; 0,1 M HC1) oder Lauge (0,02 M; 0,05 M; 0,1 M NaOH) eine definierte Zeit (10–60 sec) inkubiert. Zur Feststellung der Mitochondrienaktivität wird der Cell-Titer 96® Aqueous Solution Cell Proliferation Assay verwendet.ErgebnisseInnerhalb von wenigen Sekunden kommt es durch Säure oder Lauge in Abhängigkeit von deren Konzentration zu einer Abnahme der Mitochondrienaktivität von Bindehautzellen.SchlussfolgerungDiese Methode erlaubt es, die Schädigung der Bindehautzellen durch Säuren oder Laugen quantitativ zu messen. Damit kann man auch die Wirksamkeit von Substanzen untersuchen, die die geschädigten Zellen nach Verätzungen wieder regenerieren sollen.SummaryIntroductionChemical burns of the eye by acid or alkali may also damage conjunctival cells. We describe a method to measure the mitochondrial activity of human conjunctival cells. By this method the degree of injury to the cells by chemical agents can be determined.MethodHuman conjunctival cells (Chang cells) in cell culture were incubated with hydrochloric acid (0.02 M; 0.05 M; 0.1 M HC1) or sodium hydroxide solution (0.02 M; 0.05 M; 0.1 M NaOH) for a defined period of time (10–60 sec). To determine the mitochondrial activity of the cells the Cell Titer 96® Aqueous Solution Cell Proliferation Assay was used.ResultsWithin few seconds the mitochondrial activity of the conjunctival cells decreased depending on the concentration of the acidic or alkaline solution and on the time of incubation.ConclusionBy this method the damage of human conjunctival cells by acid or alkali can be determined quantitatively. Evaluation of the activity of substances for cell regeneration after chemical burns is also possible.