Gerhard Krause

Die Ooplasmabewegungen während der Furchung vonPimpla turionellae L. (Hymenoptera), eine Zeitrafferfilmanalyse

SummaryIn the eggs ofPimpla turionellae, which are characterized by a long germ anlage (“long-germ egg” type), the cleavage nuclei primarily populate the anterior part and only later appear in the posterior of the egg lumen during the intravitelline cleavage. Gastrulation and segmentation also start within this anterior region. Time-lapse motion pictures served to observe and to check quantitatively even slow movements during cleavage and blastogenesis. In motion diagrams made by means of microkymographic technics the flow within the ooplasm along the longer axis of the egg has been timed.Shortly before the first cleavage in thestrictly unfertilized male eggs a short-time“unipolar flow” sets in from a primary initial region at 90% of their length. Thus a pillar of “central plasm” between both of the poles becomes shifted towards the posterior, while its outer coating layer of “marginal-plasm” is displaced forwards by the same distance. In eggs from fertilized females two successive flows of the same “unipolar” type have been observed.At the end of the third cleavage the energids, heretofore loosely grouped together, become distributed within the central plasm to form a “nuclear column”. At the same time a fluently pulsatory “bipolar flow” sets in, within asecondary initial region at 80% of the egg length. Comparable to two mirror-image fountains, parts of the central plasm are carried towards the front pole and to the rear pole of the egg, respectively, while the marginal plasm, together with the oolemma, flows in opposite directions at times. With each pulsation the moving areas of the bipolar flow are shifted more and more towards the egg poles. The occurrence of bipolar flow pulsations, amounting to five, is correlated with the nuclear divisions in a still unknown way. In the rhythm of the bipolar flow, the energids become dispersed within the central plasm with a certain spatial lagging.After the bipolar flow has come to a halt, four further cleavages are indicated by faint local pulsations of the ooplasm. The cleavage nuclei move to the egg surface and pole cells become separatedtied off During blastoderm formation another four faint pulsations are observed, especially within the central ooplasm, all of them clearly synchronized with superficial cleavages. Occurring in mitotic waves, these cleavages indicate a third initial region, with the individual position varying between 10 and 28% of the egg length.Furthermore the technics of time-lapse motion pictures permit a local and temporal determination of extravitelline pole space formation, of a ring-shaped contracted region of slightly thickening periplasm within the secondary initial region, and the dislocation of the oosome towards the egg surface, which results from the activity of the posterior fountain during the phase of bipolar flow. Invagination and segmentation of the embryo become distinct within the secondary initial region, thus identifying this region as a differentiation centre.The correlation of plasm flow and nuclear divisions is discussed as well as the correlation of the initial regions to the different patterns of egg architecture in the longgerm egg type. The correlation between bipolar pulsations and the development of the metameric pattern including the function of the oosomal region is also discussed. The ooplasmic movements as known from egg types other thanPimpla are compared to the above observations.

Experimente am ungefurchten Ei vonPimpla turionellae L. (Hymenoptera) zur Funktionsanalyse des Oosombereichs

In endoplasm close to the posterior pole of the egg ofPimpla one finds conglomerated oosome material, rich in RNA. Investigations after various operations in the oosome region (10% of egg length), before cleavage were intended to show whether pole cells develop, how many segments form and if gonads contain primordial germ cells.Oosome material was squashed with a blunt glass needle. The uninjured part of the egg in front of the oosome region develops blastoderm but no pole cells. It gives rise to a fully segmentated larva with germ cells in the gonads.After ligation of up to 15% of egg length complete embryos with germ cells can develop. The smaller the anterior isolates, the more abdominal segments are missing.By ligation and invagination of the hindpole of eggs with a blunt glass needle, anteriorly material from the oosome region is combined with ooplasm situated more. Translocation of only a small amount of ooplasm results in the same number of abdominal segments in the anterior isolate as in ordinary ligated eggs. Translocation of much ooplasm yields a significantly greater number of abdominal segments. It is immaterial for the metameric segmentation of the embryo whether the oosome is situated before or behind the ligature or is destroyed. But the depth of the invagination and how many segments result do not seem to be correlated.A completely segmentated embryo can develop also after extirpation of the oosome provided care is taken not to injure the hindpole-plasm. No pole-cells result when the complete oosome is missing and the hindpole-plasm is present; loss of part of the oosome results in the development of only a few pole-cells. Thus oosome material is a necessary and quantitative condition for pole-cell differentiation. In one favourable case pole-cells developed in the extraovate because the oosome was followed after some hours by endoplasm and cleavage nuclei.Functions of the oosome are discussed: together with cleavage nuclei it is responsible for pole-cell development. As pole-cells are not invariable precursors of germ-cells, the oosome cannot contain determinants for them. Possibly it includes postembryonic growth modifiers or it could be active in gametogenesis later on. As an egg without oosome-region is able to develop an embryo, this region does not or exclusively contain an activation-center (e. g.Platycnemis), or special hind-pole factors (e. g.Euscelis). In any case the oosome itself does not include these factors. A greater number of segments in the anterior isolate after translocation of ooplasm could be due to its special quality, as inEuscelis andBruchidius whose metameric organisations originate from a bipolar ooplasmic reaction system. Also it could depend only on the increase of ooplasm competent for differentiation-factors in the middle and anterior egg parts.SummaryIn endoplasm close to the posterior pole of the egg ofPimpla one finds conglomerated oosome material, rich in RNA. Investigations after various operations in the oosome region (10% of egg length), before cleavage were intended to show whether pole cells develop, how many segments form and if gonads contain primordial germ cells.Oosome material was squashed with a blunt glass needle. The uninjured part of the egg in front of the oosome region develops blastoderm but no pole cells. It gives rise to a fully segmentated larva with germ cells in the gonads.After ligation of up to 15% of egg length complete embryos with germ cells can develop. The smaller the anterior isolates, the more abdominal segments are missing.By ligation and invagination of the hindpole of eggs with a blunt glass needle, anteriorly material from the oosome region is combined with ooplasm situated more. Translocation of only a small amount of ooplasm results in the same number of abdominal segments in the anterior isolate as in ordinary ligated eggs. Translocation of much ooplasm yields a significantly greater number of abdominal segments. It is immaterial for the metameric segmentation of the embryo whether the oosome is situated before or behind the ligature or is destroyed. But the depth of the invagination and how many segments result do not seem to be correlated.A completely segmentated embryo can develop also after extirpation of the oosome provided care is taken not to injure the hindpole-plasm. No pole-cells result when the complete oosome is missing and the hindpole-plasm is present; loss of part of the oosome results in the development of only a few pole-cells. Thus oosome material is a necessary and quantitative condition for pole-cell differentiation. In one favourable case pole-cells developed in the extraovate because the oosome was followed after some hours by endoplasm and cleavage nuclei.Functions of the oosome are discussed: together with cleavage nuclei it is responsible for pole-cell development. As pole-cells are not invariable precursors of germ-cells, the oosome cannot contain determinants for them. Possibly it includes postembryonic growth modifiers or it could be active in gametogenesis later on. As an egg without oosome-region is able to develop an embryo, this region does not or exclusively contain an activation-center (e. g.Platycnemis), or special hind-pole factors (e. g.Euscelis). In any case the oosome itself does not include these factors. A greater number of segments in the anterior isolate after translocation of ooplasm could be due to its special quality, as inEuscelis andBruchidius whose metameric organisations originate from a bipolar ooplasmic reaction system. Also it could depend only on the increase of ooplasm competent for differentiation-factors in the middle and anterior egg parts.

Die Aktionsfolge zur Gestaltung des Keimstreifs vonTachycines (Saltatoria), insbesondere das morphogenetische Konstruktionsbild bei Duplicitas parallela

Inhalt . Seite Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . 276 A. Die riiumlich-zeitliche Analyse der Keimesentwicklung . . . . . . . . . 279 I. Die normalen Entwicklungserscheinungen . . . . . . . . . . . . 279 a) Die Grundstadien und Grundbegriffe der K e i m e s e n t w i c k l u n g . . . 279 b) Die St~ndardstadien und Begriffe der Keimstreifbfldung . . . . 280 c) Der materielle Anlagenplan und die fiir die KSrpergliederung benutzten Begriffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283 IL Die aberranten Entwicklungserscheinungen . . . . . . . . . . . 285 a) Die BUS den mikrochirurgischen Methoden sich ergebenden Begriffe 286 b) Die Angaben zur Keimesentwicklung in den Isolierungsversuchen . 290 a) Operationen in den Stadien ~ d3 bis ~ ~ 6 (Beispiele in w167 1--2I) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290 fl) Operationen in den Stadien ~ d9 bis q? d12 (Beispiele in w167 22--62) . . . . . . . . . . . . . . . . . 293 y) Oper~tionen in den Stadien q2 -b 15 bis q2 -t30 (Beispiele in w167 3--94) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305 c) Die Gestaltungstypen der Duplicitas parallela . . . . . . . . . 315 B. Die konstruktiv-qualitative Analyse der Keimesentwicklung . . . . . . 322 I. Die Entwicklung der nattirlichen Teflsysteme im Ganzen . . . . . . 322 a) Die morphogenetischen Kategorien a) Sonderung, fl) Differenzierung und y) Kombhlierung . . . . . . . . . . . . . . . . . 322 b) Der Eitypus mit primordialer Metamorphose . . . . . . . . . 327 IL Die morphogenetischen Tendenzen operativ getrennter Keimteile . . 329 a) Teile der einschichtigen Keimanlage wghrend der Bfldung des Keimh5h]ensystems (Beispiele w167 1--21 in a), S. 290--293) . . . . 331 b) Keimanlagenteile wi~hrend der ]~fldung der Primitivrinne (Beispiele w167 22--62 in fl), S. 295--305) . . . . . . . . . . . . . . . . 336 c) Keimstreifteile wi~hrend des Verschlusses der Primitivrinne (Beispiele w167 3--94 in y), S. 306--315) . . . . . . . . . . . . . . 341 I I I . Die Wirksamkeit potentiell ausgezeichneter Keim~eile bei der Differenzierung der KeimhShlenblasteme . . . . . . . . . . . . . . . 346 a) Die Ausschaltung yon Differentia~oren aus dem KeimhShlensystem 349 b) Die Teilbarkeit der Differentiatoren I. und II. Ordnung . . . . . 351 c) Die Wirkung der Differentiatoren in kombinierten Keimteilen . . 352 IV. Die Synthese des morphogenetischen Konstruktionsbildes yon der Aktionsfolge zur Gestaltung des Keimstreifs . . . . . . . . . . 359

Über das Vermögen median durchschnittener Keimanlagen von Bombyx mori L. sich in ovo und sich ohne Dottersystem in vitro zwillingsartig zu entwickeln

Während sich die blastodermale Keimanlage ventral konzentriert, und ehe sie Kopflappen und Primitivrinne ausformt, ist sie in ovo und in vitro jeweils in etwa 160 Fällen median durchschnitten worden. Wenn die Isolate in ovo nicht wieder verschmelzen und in vitro lange genug am Leben bleiben, können sie sich zu getrennten Halbkeimstreifen oder zwillingsartigen Regulations-Keimstreifen entwickeln. Man erhält nur am Vorderende und am Hinterende regulierte Isolate, wenigstens stellenweise ektodermal symmetrisierte, mit unterlagertem Strang prädestinierten Mesoderms, mesodermlose mit symmetrisiertem Ektoderm einschließlich des präsumptiven Mesoderms, vollregulierte mit epigenetisch gesondertem Mesodermstrang in der Mediane jedes Partners und vollregulierte mit ausgebreitetem Mesoderm. Ausgewählte repräsentative Fälle werden beschrieben und ihre verschiedenen Entwicklungsleistungen in ovo und in vitro werden verglichen und diskutiert. Die Regulation scheint in ovo begünstigt zu sein, weil die Stoffwechselbedingungen besser sind, und dadurch eine lange Entwicklungszeit ermöglicht wird. Mesodermlose Zwillingskeimstreife sind in vitro zu finden, vielleicht weil die epigenetischen Primitivrinnen erst nach längerer Zeit gebildet werden könnten. Auch für die regulative Verlagerung des präsumptiven Mesoderms am Schnittrand unter die Seitenplatte und für ihre Symmetrisierung scheint der Zeitfaktor wichtig zu sein. Der Kontakt mit dem Dottersystem hat für die regulativen Gestaltungsbewegungen ebenso wenig Bedeutung wie für die normalen beim Schichtenbau einer Ganzkeimanlage in vitro.

Postembryonales und regeneratives Wachstum der Cerci und der Beinglieder vonTachycines (Saltatoria)

SummaryThe postembryonic and regenerative growth capacities of cerci and legs were investigated inTachycines asynamorus. The normal length and growth of cerci and segments of the middle legs, and the number and duration of normal postembryonic instars were determined in isolated individuals. In the regeneration experiments, the animals were amputated after the molt into the second postembryonic instar.An organotypic cercus is regenerated after 2–3 molts. The increment of length between molts is about constant, normal length is never acquired. If amputation occurs within the first three days after the molt, a papilla or a small regenerate will usually be present after the next molt. The molting rate is decreased during the next 3–4 molts. If the amputation is performed later, no regenerate will usually appear until after two molts. In this case the average molting rate is not significantly decreased.An organotypic tarsus of the middle leg is present 1–3 molts after amputation, an organotypic tibiotarsus 3–4 molts after amputation. Normal proportions are reached after 6–8 molts. If the femur is also removed, no regeneration takes place. Seven potential steps of regenerative differentiation were distinguished. The earlier the amputation, the faster the regeneration. The total duration of development to the ninth instar is about the same in normal and regeneration individuals because in the latter the initial slowing down of molting is compensated by an increased molting rate after the fourth instar.The existence of certain organ-specific critical periods is postulated for each molt interval. Before such a period, regeneration may be elicited and can follow its autonomous course. After the critical period has elapsed, no regeneration blasteme can grow any more during that molt interval. There is evidence, that the critical period for cereal regeneration lies in the first half, for tarsal regeneration in the second half, and for tibiotarsal regeneration in the middle part of the molt interval. The pattern which happens to be determined in the epidermis blasteme, will become expressed in the cuticle through the process of molting.A comparison of the findings onTachycines, Carausius and some blattids leads to the following working hypothesis, inviting histological and further experimental analysis: Cerci have a proximal blasteme which exhibits proliferative growth during normal development and regeneration. In regeneration legs during segmentation the situation is similar, during growth after segmentation and during normal postembryonic growth, there is a self-regulatory control of limp proportions. The causes responsible for all types of growth are to be sought in the cycle of the hormonal system, and in the site and age specific competence of the cells.Zusammenfassung1.Tachycines asynamorus hat 11Postembryonalstadien. In der Mehrheit werden die Weibchen durch ein 12. Jugendstadium größer als die Männchen. Die Häutungsintervalle sind bei Männchen im allgemeinen länger als hei Weibchen. Sie können individuell sehr verschieden lang sein. Das zweite ist das kürzeste; das letzte ist 2–3mal so lang. Cerci und Mittelbeinglieder sind hei Männchen und Weibchen durchschnittlich gleich lang, die Zuwachsrate steigt leicht an. Die Wachstumsgradienten der Beine und ihrer Glieder sind verschieden. Ihre Proportionen können von Häutung zu Häutung aufeinander abgestimmt werden.2.Die Zweitlarve benötigt bei sehr früherAmputation eines Cercus 2, sonst 3 Häutungsintervalle zur Bildung eines organotypischen Regenerats. Der Wachstumsgradient des Regenerationscercus ist anscheinend konstant. Im Mittel bleiben die Längendifferenzen der regenerierten Cerci gegenüber normalen und zwischen denen früh und spät operierter Tiere erhalten. Zweitlarven, die postoperativ eine Papille oder ein Regenerat haben, häuten sich 3–4mal verzögert und holen dann den Zeitverlust wieder auf. Zweitlarven ohne Regeneration häuten sich erst als Drittlarven etwas verzögert und auch weiterhin nur wenig später als die Kontrollen.3.Es wird auf einen für die Cercusregenerationkritischen Zeitpunkt vor der Mitte des Häutungsintervalls geschlossen. Vor ihm kann jederzeit regenerative Entwicklung operativ ausgelöst werden oder in einem postoperativen Stadium zellautonom wieder anlaufen; nach ihm kann ein Regenerationsblastem nicht mehr wachsen.Regenerativer und postembryonaler Wachstumsmodus des Cercus müssen sich sehr ähnlich sein und ineinander übergehen, ohne sich zu überlagern.4.Die Zweitlarve zeigt nachAmputation von Tarsalgliedern des Mesothorax bis zu 5 potentielle Regenerationsstufen: Narbe, Papille, ungegliedertes Primärregenerat mit Krallen, zwei- und viergliedriger Tarsus. Sie benötigt nach früher Operation 1–2, nach später 2–3 Häutungen für einen vollständig gegliederten aber untypisch proportionierten Tarsus. Die organotypische Regeneration einesTibiotarsus wird in einigen von 7 möglichen Stufen vollzogen und nimmt 3–4 postoperative Häutungsintervalle in Anspruch. Die „Tatze“, ein Regenerat aus Tibiaanlage und ungegliederter bekrallter Tarsusanlage, macht das Bein schon funktionsfähig. Zweitlarven können zwischen Trochanter undFemur amputierte Beine nicht regenerieren.5.Die Mittelbeinregenerate werden in denLängenproportionen der Glieder dem Vergleichsbein angeglichen. Die mittleren Tarsalglieder werden am kleinsten angelegt und wachsen am langsamsten. Ein Tarsus ist nach dem 7., ein Tibiotarsus nach dem 9. Larvenstadium vollendet. Eine Tibia hat schon nach dem 7. Stadium die richtige Länge; sie entwickelt ihr Pigmentmuster nicht wieder. Im Regenerat und im Beinstumpf können einzelne Glieder durch gesteigertes Wachstum schon normale Gesamtlänge des Beines bedingen, ehe alle Glieder durch „Einpendeln“ des Wachstums richtig proportioniert werden.6.Mittelbeinregeneration bedingtzuerst längere, dann kürzere Häutungsintervalle als bei den Kontrolltieren. Drittlarven mit Narbe verlängern erst dieses postoperative Stadium, in dem sie das Regenerationsblastem aufbauen. Im 9. Larvenstadium sind etwa gleiche Zeitsummen der Postembryonalentwicklung wie bei Kontrollen erreicht.7.Es kann auch auf einen für die Regeneration von Mittelbeingliedernkritischen Zeitpunkt im Larvenstadium geschlossen werden, vor dem jederzeit regenerative Entwicklung ausgelöst werden kann. Er scheint für Tarsusamputation hinter der Mitte und für Tibiotarsusamputation vor oder in der Mitte des Häutungsintervalls zu liegen. Die sich wandelnden Bedingungen des inkretorischen Systems stehen also in einer Relation zu örtlichen Verschiedenheiten des reagierenden Gewebes. Regenerativer Aufbau und postembryonale Vergrößerung der Extremität werden nach der kritischen Intervallzeit vorübergehend unterbrochen, wenn das Häutungsgeschehen das gerade im Epidermisblastem determinierte Muster kutikular realisiert.8.Speziell das Epidermisgewebe einer Extremität ist während seiner normalen postembryonalen Entwicklung nicht so stark in seiner Wachstumspotenz beansprucht wie während seiner regenerativen Entwicklung. Das Beinregenerat wächst proximal am stärksten in die Länge und differenziert sich distal zuerst. Das organotypisch gegliederteRegenerat wächst noch heran und nimmt doch schonhemmend oder fördernd an dem postembryonalen Wachstum des Stumpfes teil, so daß das ganze Regenerationsbein seine Gliedlängen artspezifisch modifiziert und auf das Vergleichsbein abstimmt. Regenerativer und postembryonaler Wachstumsmodus der Thoraxextremität sind verschieden und überlagern sich.9.Die Diskussion der Ergebnisse wird im wesentlichen auf einen Vergleich vonTachycines, Carausius und verschiedene Arten der Blattidae beschränkt. Er kann insbesondere bezüglich der Wechselbeziehungen zwischen Regenerationsleistung und Häutungszyklus zu Vorstellungen undArbeitshypothesen für die histologischen und die weiteren experimentellen Untersuchungen führen. Die Cerci haben vielleicht, ähnlich wie die Antennengeißeln der Schaben in ihrer Vorzone, ein basales postembryonales Blastem mit proliferativem Wachstum, das nach Amputation wieder selbstregulatorisch funktionieren, aber distale Verluste nicht ausgleichen kann. Das Regenerationsblastem eines Beines hat vielleicht bis zu seiner organotypischen Gliederung eine gewisse Ähnlichkeit mit diesem proliferativen Bildungsmodus. Das folgende regenerative Wachstum kann sich im Rahmen des normalen postembryonalen Wachstums mit sellbstregulatorischer Kontrolle der Gliedproportionen des Beines abspielen. Die Bedingungen für alle Wachstumsmodi sind im Zyklus des inkretorischen Systems und in der orts- und altersspezifischen Kompetenz der Zellen zu suchen.The postembryonic and regenerative growth capacities of cerci and legs were investigated inTachycines asynamorus. The normal length and growth of cerci and segments of the middle legs, and the number and duration of normal postembryonic instars were determined in isolated individuals. In the regeneration experiments, the animals were amputated after the molt into the second postembryonic instar.An organotypic cercus is regenerated after 2-3 molts. The increment of length between molts is about constant, normal length is never acquired. If amputation occurs within the first three days after the molt, a papilla or a small regenerate will usually be present after the next molt. The molting rate is decreased during the next 3-4 molts. If the amputation is performed later, no regenerate will usually appear until after two molts. In this case the average molting rate is not significantly decreased.An organotypic tarsus of the middle leg is present 1-3 molts after amputation, an organotypic tibiotarsus 3-4 molts after amputation. Normal proportions are reached after 6-8 molts. If the femur is also removed, no regeneration takes place. Seven potential steps of regenerative differentiation were distinguished. The earlier the amputation, the faster the regeneration. The total duration of development to the ninth instar is about the same in normal and regeneration individuals because in the latter the initial slowing down of molting is compensated by an increased molting rate after the fourth instar.The existence of certain organ-specific critical periods is postulated for each molt interval. Before such a period, regeneration may be elicited and can follow its autonomous course. After the critical period has elapsed, no regeneration blasteme can grow any more during that molt interval. There is evidence, that the critical period for cereal regeneration lies in the first half, for tarsal regeneration in the second half, and for tibiotarsal regeneration in the middle part of the molt interval. The pattern which happens to be determined in the epidermis blasteme, will become expressed in the cuticle through the process of molting.A comparison of the findings onTachycines, Carausius and some blattids leads to the following working hypothesis, inviting histological and further experimental analysis: Cerci have a proximal blasteme which exhibits proliferative growth during normal development and regeneration. In regeneration legs during segmentation the situation is similar, during growth after segmentation and during normal postembryonic growth, there is a self-regulatory control of limp proportions. The causes responsible for all types of growth are to be sought in the cycle of the hormonal system, and in the site and age specific competence of the cells.

Beobachtungen in vitro an den Zellen der Larvalen Ovariolenhülle von Bombyx mori L. (Lepidoptera) in Verschiedenen Kulturmedien

SummaryThe cells of the intermediate layer enveloping the ovarioles of the old Bombyx larvae may be cultured by the hanging drop method. Using various culture fluids (methods see p. 395; modifications see p. 405) the following results are obtained: Under favourable conditions the intermediate cells will leave the explanted piece of ovariole by ameboid movement and populate the surrounding area. They assume oligogonal shape. Normal mitosis occurs but binucleate cells are also formed by amitosis. Inactive polygonal cells form either a network or a pseudoepithelium. Aging cells accumulate metabolic products; their nuclei degenerate. The cultures usually die after one sometimes after three weeks, even if the explantate is removed and the medium renewed.Under unfavourable conditions most cells do not emigrate; they often change colour. If cells emigrate they may have a threadlike “starved” or strongly vacuolized “gorged” appearance. Since the cells of the intermediate layer in situ do not differentiate into functionally diverse types, the cultivated cells probably start from the same physiological point. An inventory of the structural characteristics of in vitro cells is given. Certain characteristics are taken to serve as criteria for the quality of the culture fluids used.Results obtained from 664 explantates are reported. Culture fluids with high or low nutrient concentration, with or without hemolymph or egg extract are used (table p. 406–408).Salt solutions with monosaccharides and/or disaccharides are not sufficient. Protein hydrolysates (e.g. Vago) or amino acids — as present in larval hemolymph (Wyatt) — are required. A molar ration of Na ∶ K c. 0.2 ∶ 1 is essential. The addition of hemolymph extract improves otherwise insufficient media. Egg extracts lead to hyperthrophy. The addition of vertebrate extracts and/or trehalose proved unsuccessful.The following factors are important for the culture of insect cells:A species and stage specific ratio of Na+ ∶ K+; the presence of sugar and protein derivatives; traces of certain substances which in our tests are supplied by extracts from the original organism.ZusammenfassungDie Hüllzellen der Ovariolen von Bombyx-Altlarven sind geeignet für Zellkulturen im hängenden Tropfen. Die Erfahrungen, welche mit Kulturmedien verschiedener Autoren und mit einigen Varianten gesammelt worden sind, werden mitgeteilt.Unter günstigen Bedingungen wandern die Hüllzellen vom explantierten Ovariolenstück ab und bevölkern oligogonal amöboid die Umgebung. Mitosen, aber auch zweikernige Zellen nach Amitose treten auf. Inaktive polygonale Zellen bilden ein Netzwerk oder ein Pseudoepithel. Alternde Zellen speichern Stoffwechselprodukte; ihre Kerne degenerieren. Die Kultur stirbt nach etwa 1 Woche und spätestens nach 3 Wochen, auch wenn das Mutterstück entfernt und das Medium erneuert worden ist.Unter ungünstigen Bedingungen wandern die Zellen nicht ab und verfärben sich, oder es treten fadenförmige „Hungerzellen“ oder stark vakuolisierte „Mastzellen“ auf.Da sich in situ nicht verschiedene Funktionszellen differenzieren, haben die kultivierten Zellen wahrscheinlich den gleichen entwicklungsphysiologischen Anfangszustand. Ein Inventar ihrer Form- und Strukturmerkmale in vitro wird aufgestellt. Einige werden als Kriterien für die Güte des Mediums ausgewählt.Die Ergebnisse in 664 Explantaten in nährstoffarmen und -reichen Kulturlösungen ohne und mit Zusatz von Hämolymphe oder Eiextrakt werden beschrieben (Tabelle, S. 406).Salzlösungen mit Zucker reichen nicht aus, dagegen solche mit Zusatz von Aminosäuren, wie sie in der Raupenhämolymphe vorkommen (Wyatt), oder von Eiweißhydrolysat (Vago). Voraussetzung ist ein molares Verhältnis Na ∶ K von etwa 0,2 ∶ 1. Der Zusatz von Hämolympheextrakt bringt auch für ungünstige Kulturlösungen eine Verbesserung, der von Eiextrakt führt zur Hypertrophie. Wirbeltierextrakte haben sich nicht bewährt. Trehalose hat keinen Vorteil gebracht.Die Erfahrungen werden im Hinblick auf die Angaben anderer Autoren diskutiert. Wesentlich für die Kultur von Insektenzellen sind: das art- und stadienspezifische molare Verhältnis der Na ∶ K Kationen, die Anwesenheit von Zucker und Proteinderivaten und von Spurenstoffen, die vorläufig nur mit Extrakten aus dem Spender-Organismus gegeben werden können.

Untersuchungen mittels Röntgenbestrahlung über den Radula-Ersatz der NacktschneckeLimax flavus L.

1. The naked snailLimax flavus L. has a radula with longitudinal rows of uniform teeth and cross-rows of teeth with a gradually changing form towards the radulas edge in regular succession, (Fig. 1). The individual tooth sits on the front part of a basal plate. This lies on the radula membrane (Fig. 2). 2. The radula is constantly shortened at its frontal end and is continuously renewed at the rear end of the radula gland. - This is an epidermal fold of the mouth cavity. At this place of radula-development lies a region of large secretion-cells, the odontoblasts. These are arranged together in groups (Fig. 10, 11 and 13). Each longitudinal toothrow with the underlying membrane, is produced by one group of odontoblasts. Each group for a lateral tooth in the medial region of the radula consists of 15 cells. During the substitution of the cross-row processes of developing teeth in the medial part get more and more ahead of those at the edge. 3. In an odontoblasts-group one finds division of labour. The front cells produce membrane material and the basal plate. The rear cells of the group produce the tooth. During the formation of the tooth the rear cells change their apical surface profile. The form of the tooths upperside corresponds to the apical profile of cells at the beginning of secretion (Fig. 14a, 15a, b). The form of the tooths furrow responds to that of the apical odontoblasts-profile at the end of secretion (Fig. 14b, 15c). The odontoblasts are exclusively responsible for the definitive shape of the tooth. 4. After a single whole-body X-irradiation of young snails (dosis-range: 8,050-130,000 R, Table 2) a characteristically changed pattern of teeth arises. A region of cross-rows, following each other closer than normal, extends across the radula (Fig. 4, 80,500 R). The condensation of cross-rows depends on the dosis (Fig. 8, broken-lined graph). Slides show an abnormal form and irregular position of teeth and their basal plate (comp. Fig. 2a, b and 17). 5. The radula replacement system shows great resistance against X-rays. Up to a dosis of 113,000 R it is able to recover. It can again develop more or less normally formed and situated teeth and basal plates. Only after a dosis of 130,000 R (LD100:6 days, Table 2) odontoblasts do not recover, although they produce up to 9 cross-rows before the death of the snails. 6. After irradiation of a snails body with 64,400 R, the head being shielded, the radula remains without traces of this treatment (comp. Fig. 5, whole-body X-irradiation with 64,400 R). 7. After irradiation with low R-dosis an insignificant defect-streak develops across the radula. This was used as time-mark in order to count the cross-rows which have grown until preparation of the radula or setting of a second defect-mark. Hereby an average rate of replacement per day can be established, which may be looked upon as normal. The rate of 3.1 cross-rows per day with 48 day old snails falls to 1.4 cross-rows per day with 1 to 2.5 year old animals (Fig. 7, drawn-out graph). The average normal tooth-length increases with the age (Fig. 7, broken-lined graph). 8. To examine the effect of rising R-dosis on the rate of replacement, the cross-rows are counted which developed within 12 days after exposure (dosis: 8,050-80,500 R, Table 2 a-e). The number of cross-rows is reduced with rising dosis (Fig. 8, drawn-out graph). 9. After irradiation with 96,600 and 113,000 R groups of young snails were killed in periods of 12-168 hours after exposure (Fig. 9) to determine the actual daily replacementrate of cross-rows resulting to a high dosis. In the first 24 hours after 113,000 R the radula replacement is strongly reduced (Fig. 9, drawn-out graph). From 24-168 hours about 2.0 new cross-rows developed daily, compared to a normal rate of 2.9 cross-rows daily in animals of the same age. The pattern of malformation in the radula after a high dosis develops with slackened but very continuous replacement-rate of rows (comp. Fig. 9, broken-lined graph for 96,600 R). 10. In the epithelium at the back of the radula gland one finds several very different damages. The mitotically very active proliferation zones directly anterior and posterior to the odontoblasts-zone are considerably damaged. From 96 hours after exposure, there can be found lots of pycnotic nuclei (Fig. 18b). Extensive gaps appear in the tissue. On the other hand the odontoblasts-zone has a great compatibility against X-rays. Even 168 hours after exposure the odontoblasts are found to be completely existant. They were able to develop 12-15 cross-rows after irradiation. Merely the appearence of the odontoblasts changes. The front cells of the odontoblasts-group are lower, the posterior ones slimmer than normal. The number of radula glands with changed odontoblasts increases up to 96 hours after exposure, and decreases again until 168 hours after exposure. 11. The irregular slim rear odontoblasts have a narrowed apical area for tooth-formation (comp. Nr. 3 of the summary). Thus the tooth produced by these cells is shorter than normal. 12. The hypothesis of odontoblast-substitution states that the cells which develop the radula are continuously replaced by cells of the end-epithelium lying behind the odontoblasts-zone. After irradiation with 113,000 R replacement can not have taken place, as the tissue directly anterior and posterior to the odontoblasts-zone was extremely damaged. The odontoblasts were permanently active during the time of experiment, 168 hours after exposure. Finally they could again produce regular teeth. These findings supportthe hypothesis of the permanenec of odontoblasts.Summary1.The naked snailLimax flavus L. has a radula with longitudinal rows of uniform teeth and cross-rows of teeth with a gradually changing form towards the radulas edge in regular succession, (Fig. 1). The individual tooth sits on the front part of a basal plate. This lies on the radula membrane (Fig. 2).2.The radula is constantly shortened at its frontal end and is continuously renewed at the rear end of the radula gland. — This is an epidermal fold of the mouth cavity. At this place of radula-development lies a region of large secretion-cells, the odontoblasts. These are arranged together in groups (Fig. 10, 11 and 13). Each longitudinal toothrow with the underlying membrane, is produced by one group of odontoblasts. Each group for a lateral tooth in the medial region of the radula consists of 15 cells. During the substitution of the cross-row processes of developing teeth in the medial part get more and more ahead of those at the edge.3.In an odontoblasts-group one finds division of labour. The front cells produce membrane material and the basal plate. The rear cells of the group produce the tooth. During the formation of the tooth the rear cells change their apical surface profile. The form of the tooths upperside corresponds to the apical profile of cells at the beginning of secretion (Fig. 14a, 15a, b). The form of the tooths furrow responds to that of the apical odontoblasts-profile at the end of secretion (Fig. 14b, 15c). The odontoblasts are exclusively responsible for the definitive shape of the tooth.4.After a single whole-body X-irradiation of young snails (dosis-range: 8,050–130,000 R, Table 2) a characteristically changed pattern of teeth arises. A region of cross-rows, following each other closer than normal, extends across the radula (Fig. 4, 80,500 R). The condensation of cross-rows depends on the dosis (Fig. 8, broken-lined graph). Slides show an abnormal form and irregular position of teeth and their basal plate (comp. Fig. 2a, b and 17).5.The radula replacement system shows great resistance against X-rays. Up to a dosis of 113,000 R it is able to recover. It can again develop more or less normally formed and situated teeth and basal plates. Only after a dosis of 130,000 R (LD100:6 days, Table 2) odontoblasts do not recover, although they produce up to 9 cross-rows before the death of the snails.6.After irradiation of a snails body with 64,400 R, the head being shielded, the radula remains without traces of this treatment (comp. Fig. 5, whole-body X-irradiation with 64,400 R).7.After irradiation with low R-dosis an insignificant defect-streak develops across the radula. This was used as time-mark in order to count the cross-rows which have grown until preparation of the radula or setting of a second defect-mark. Hereby an average rate of replacement per day can be established, which may be looked upon as normal. The rate of 3.1 cross-rows per day with 48 day old snails falls to 1.4 cross-rows per day with 1 to 2.5 year old animals (Fig. 7, drawn-out graph). The average normal tooth-length increases with the age (Fig. 7, broken-lined graph).8.To examine the effect of rising R-dosis on the rate of replacement, the cross-rows are counted which developed within 12 days after exposure (dosis: 8,050–80,500 R, Table 2 a–e). The number of cross-rows is reduced with rising dosis (Fig. 8, drawn-out graph).9.After irradiation with 96,600 and 113,000 R groups of young snails were killed in periods of 12–168 hours after exposure (Fig. 9) to determine the actual daily replacementrate of cross-rows resulting to a high dosis. In the first 24 hours after 113,000 R the radula replacement is strongly reduced (Fig. 9, drawn-out graph). From 24–168 hours about 2.0 new cross-rows developed daily, compared to a normal rate of 2.9 cross-rows daily in animals of the same age. The pattern of malformation in the radula after a high dosis develops with slackened but very continuous replacement-rate of rows (comp. Fig. 9, broken-lined graph for 96,600 R).10.In the epithelium at the back of the radula gland one finds several very different damages. The mitotically very active proliferation zones directly anterior and posterior to the odontoblasts-zone are considerably damaged. From 96 hours after exposure, there can be found lots of pycnotic nuclei (Fig. 18b). Extensive gaps appear in the tissue. On the other hand the odontoblasts-zone has a great compatibility against X-rays. Even 168 hours after exposure the odontoblasts are found to be completely existant. They were able to develop 12–15 cross-rows after irradiation. Merely the appearence of the odontoblasts changes. The front cells of the odontoblasts-group are lower, the posterior ones slimmer than normal. The number of radula glands with changed odontoblasts increases up to 96 hours after exposure, and decreases again until 168 hours after exposure.11.The irregular slim rear odontoblasts have a narrowed apical area for tooth-formation (comp. Nr. 3 of the summary). Thus the tooth produced by these cells is shorter than normal.12.The hypothesis of odontoblast-substitution states that the cells which develop the radula are continuously replaced by cells of the end-epithelium lying behind the odontoblasts-zone. After irradiation with 113,000 R replacement can not have taken place, as the tissue directly anterior and posterior to the odontoblasts-zone was extremely damaged. The odontoblasts were permanently active during the time of experiment, 168 hours after exposure. Finally they could again produce regular teeth. These findings supportthe hypothesis of the permanenec of odontoblasts.Zusammenfassung1.Bau und Ersatz der normalen Radula vonLimax flavus werden beschrieben. Die Zahnbildungsvorgänge für eine Querreihe von Zähnchen laufen von der Radula-Mitte zu den -Rändern zeitlieh immer mehr voraus. Jede Zahnlängsreihe mit darunterliegendem Membrananteil wird voneiner Odontoblasten-Gruppe in Arbeitsteilung produziert. Eine solche Baugruppe für den mittleren Seitenzahnbereich der Radula besteht aus 15 Zellen. Die vorderen Zellen erzeugen Membranmaterial und die Basalplatte. Die hinteren Zellen erzeugen den Zahnaufsatz. Sie ändern dabei ihr apikales Oberflächenprofil. Die Form des Zahnrückens entspricht dem apikalen Profil der Zellen zu Beginn der Sekretion, die Form der Zahn-Hohlkehle entspricht ihrem apikalen Profil zu Ende der Sekretion (Abb. 14, 15). Ausschließlich die Odontoblasten geben dem Zahn seine endgültige Gestalt.2.Nach einmaliger Totalbestrahlung mit mittlerer bis hoher Dosis (Tabelle 2) entsteht ein charakteristisch abgeändertes Zähnchenmuster. Die Verdichtung der Querreihen ist dosisabhängig. Nach demSchnittpräparat ergibt sich die Reihendrängung aus abnormem Bau und abnormer Stellung der Zähne und ihrer Basalplatte. Das Radula-Ersatzsystem ist sehr strahlenresistent, es vermag wieder annähernd normal gebaute und gelagerte Zähne und Basalplatten auszubilden. Erst nach einer Dosis von 130000 R (LD100:6 Tage) erholen sich die Bildungszellen nicht mehr. Sie produzieren aber vor dem Absterben der Tiere bis zu 9 Querreihen.3.Eine Bestrahlung des Schneckenkörpers mit 64400 R beiabgeschirmtem Kopf mit Radulascheide hinterläßt in der Radula keine Spuren.4.Der geringfügige Defektstreifen nach Bestrahlung mit niedriger R-Dosis ist als Zeitmarke benutzt worden, um die bis zur Präparation der Radula oder bis zum Setzen einer 2. Defektmarke ausgebildeten Querreihen zu zählen. Einedurchschnittliche tägliche Ersatzrate, die als normal angesehen werden darf, fällt von 3,1 Querreihen bei 48tägigen Jungschnecken auf 1,4 pro Tag bei ausgewachsenen, 1–2,5 Jahre alten Tieren. Die mittlere normale Zahnlänge steigt mit dem Alter an.5.Um die Wirkung der Dosis (8050–80500 R) auf die Ersatzrate zu prüfen, sind die in 12 Tagen nach Exposition gebildeten Querreihen ausgezählt worden. Die Zahl der Querreihen verringert sich mit steigender Dosis. Nach Bestrahlung mit 96600 und 113000 R sind Gruppen von jungen Schnecken in Zeitabständen von 12–168 h nach Exposition abgetötet worden, um dentatsächlichen täglichen Reihenzuwachs nach hoher Dosis zu bestimmen. Von 24–168 h werden täglich etwa 2,0 neue Querreihen ausgebildet gegenüber normal 2,9. Das Mißbildungsmuster entsteht also bei verlangsamtem, aber sehr kontinuierlichem Reihenzuwachs.6.Im Epithel der hinteren Radulascheide treten nach 113000 R sehr unterschiedliche Schäden auf. Die mitotisch sehr aktiven Proliferationsbereiche unmittelbar vor und hinter dem Odontoblasten-Gürtel sind sehr stark geschädigt. Ab 96 h nach Exposition liegen in ihnen Massen von pyknotischen Kernen, und es entstehen ausgedehnte Lücken im Gewebeverband. DerO- Gürtel ist dagegen sehr strahlenverträglich. Auch im ältesten untersuchten Tagesstadium, 168 h nach Exposition, sind die Bildungszellen noch vollständig vorhanden. Sie haben nach der Bestrahlung 12–15 Querreihen ausbilden können. Lediglich dasAussehen der Odontoblasten ändert sich. Die vorderen Zellen einer Baugruppe werden niedriger, die hinteren wesentlich schlanker als normal. Diese besitzen eineeingeengte apikale Zahn-Bildungsfläche; der von ihnen produzierte Zahn wird deshalb kürzer als normal. Der Anteil an Radulascheiden mit dem entsprechend veränderten Odontoblasten nimmt bis 96 h nach Exposition zu und danach bis 168 h nach Exposition wieder ab.7.Nach der Hypothese des Odontoblasten-Ersatzes würden die Radula-Bildungszellen ständig durch Zellen des hinter dem Odontoblasten-Gürtel gelegenen Endepithels ersetzt. Nach der Bestrahlung mit 113000 R kann jedoch ein Ersatz nicht stattgefunden haben, da die Gewebe unmittelbar vor und hinter demO-Gürtel sehr stark strahlengeschädigt sind. Die Odontoblasten waren also im Untersuchungszeitraum, 168 h,permanent tätig. Zuletzt konnten sie wieder annähernd normale Zähne bilden. Diese Befunde stützen die Gegenthese von derPermanenz der Odontoblasten.

Nester aberranter Schuppen nach R-Bestrahlung der Flügelanlagen in weiblichen Diapause- und Nondiapauseraupen vonPlodia (Lepidoptera)

SummaryIn diapausing last-instar caterpillars (rearing temperature 20° C) of the Indian Meal MothPlodia interpunctella H., all nuclei of the posterior wing anlagen (about 2700 cells each) are in the prophase stage. In non-diapausing larvae (30° C), on the other hand, a considerable variety of mitotic stages can be observed.When female caterpillars are irradiated (4000 R) in the 2700 cell stage, clusters of aberrant scales are found on the wing of the imago. The appearence of scales may vary within one cluster. 10 different “somatic mutants” are distinguishable on the upper side of the posterior wing. Their differences in shape, color, and pattern of the ribs are described.The two most frequent “somatic mutants”, PS 1 (808 “mutations” in all) and PS 3 (184 “mutations”) were evaluated quantitatively: In irradiated wings, the ratio of PS 1 clusters of diapause vs. non-diapause wings (100∶57) is similar to the corresponding ratio of prophase stages (100∶56). For PS 3, the cluster ratio is 100∶87. In unirradiated wings, clusters of both mutants are rare. There are no differences of the frequencies of solitary mutant scales between irradiated and unirradiated wings.The question is discussed, whether the mutations are induced hi a non-diapausing wing anlage during the prophase stages only.Zusammenfassung8 Tage nach dem Schlüpfen aus dem Ei gehen von 30° C in 20° C gebrachte Raupen als eingesponnene Letztraupen 6 Monate in eine temperaturabhängige Diapause. Die Hinterflügelanlage einschließlich Säckchen besteht aus etwa 2700 Zellen, deren Kerne alle in einem frühen Prophasestadium stehenbleiben. Dieselbe Zellenanzahl hat eine durchgehend in 30° C gehaltene Nondiapause-Raupe 2 Tage nach der Häutung zur Letztraupe. Nur etwa 56% der Kerne in der Flügelanlage befinden sich im Prophasestadium.Die weibliche 2700-Zellen-Flügelanlage erhielt immer 4000 R. Je 100 Tiere in 30-Tage-Diapause bestrahlt und unbestrahlt und je 100 Tiere in Nondiapause bestrahlt und unbestrahlt bilden eine Versuchsgruppe. Mit einem zeitlichen Abstand wurde eine gleiche Versuchsgruppe angesetzt. Schräges Auflicht erleichterte die Suche nach R-induzierten und spontanen somatischen Schuppenmutanten auf den 1600 Hinterflügeln.Die Normalschuppe tritt in mehr oder weniger standortgebundenen Differenzierungstypen und eingestreuten Modifikationen auf. Auch in den Nestern mutierter Schuppen kommen verschiedene Varianten vor. 10 R-induzierte somatischePlodia-Schuppenmutanten werden, z. T. mit Varianten, nach Gestalt, Rippenverlauf und Farbe gekennzeichnet. Die beiden am häufigsten registrierten Mutanten PS 1 und PS 3 werden zu Schlußfolgerungen herangezogen. Nur die Mutante PS 5 ist nicht auf unbestrahlten Flügeln gefunden worden.Die Häufigkeit der Einzelschuppen ist auf bestrahlten und unbestrahlten Flügeln gering und nicht gesichert verschieden (Tabelle 2). Nester von PS 1 und PS 3 kommen sehr selten auf unbestrahlten Flügeln vor. Die R-induzierten Nester bestehen durchschnittlich aus 18–20 Schuppen. Die PS 1-Nester sind auf linken und auf rechten Flügeln und im I. und im II. Versuch gleich häufig, sind aber fast doppelt so häufig auf Diapauseflügeln wie auf Nondiapauseflügeln anzutreffen (Tabelle 3). Die Relationen sind bei den nicht so häufigen PS 3-Nestern nicht so klar abzulesen, vor allem ist nicht ein entsprechender Unterschied zwischen Diapause- und Nondiapause-Flügeln ausgeprägt.Probleme des entwicklungsphysiologischen und des radiophysiologischen Zustands der 2700-Zellen-Flügelanlage in Diapause und in Nondiapause und Bedingungen für die Variation der Nestgröße und Nestform und der Schuppenmerkmale werden diskutiert. Zur Beurteilung der Mutanten PS 1 und PS 3 werden die Ergebnisse zu HO 1 und HO 5 (v.Aufsess, 1967, anPlodia) herangezogen. Die Übereinstimmung der Häufigkeit der Prophasekerne und der R-induzierten Nester von PS 1-Schuppenmutanten bei Diapause- und Nondiapause-Flügelanlagen führt zur Arbeitshypothese, diese Mutante könne nur im Prophase-Kernzustand und im übrigen unabhängig vom entwicklungsphysiologischen Zustand der Zelle induziert werden. Für die weniger häufige somatische Mutation PS 3 scheint diese Hypothese nicht zuzutreffen. Sie soll durch Bestrahlungsversuche an verschieden alten Postdiapause-Stadien mit verschiedenen Relationen der Kernzustände geprüft werden.

Die Entwicklung prospektiver Diapause-Keime (Bombyx mori L.) in vitro ohne Dormanz

SummaryIn a foreign protein medium (LTS), naked prospective diapause-germs have a tendency to develop into fully segmented germ bands (stage of dormancy): however, deposition of chorion, serosa or yolk will stimulate themvia the medium to pass through organogenesis without delay (non-dormancy =Nd). The question remained if a germ from a non-diapausing egg would stimulate the uninterrupted development of such a test-germ (Tk). Using 2 different or 2 to 3 equal germs as well asTk alone (control) in hanging drops, experimental evidence was obtained permitting conclusions not only as to the competence and sensitivity of the embryonic reaction system, but also as to factors of the extraembryonicNd-action systems in eggs with and without predetermined diapause regulatory mechanism.1.Control explants (1 prospective diapause-Tk inLYS) have aNd-level of 10% (= average ofNd-rates in operative stages). This difference from former controls (0%Nd) can be explained by the longer operative procedure in the cups when several test-germs were used. Seven minutes after opening an egg one can reckon on aNd-stimulationvia LYS medium from egg-residues in the operation cup. While transfering the test-germs, yolk-derived substances related to theNd-stimulation can be brought into the hanging drop. The difference betweenNd-controls and the results ofNd-stimulation have to be statistically significant.2.In experiments with two different germs in LYS-droplets no influence of a non-diapause germ (polyvoltine) on a prospective diapause germ (univoltine) could be noted. Accordingly, the naturally prospectiveNd-germs, have a tendency to develop to dormant germs only, as do the 2Tk and 1Tk controls. In combination with artificially prospectiveNd-germs (univoltine, HCl-treated) no stimulation of the test germ occcurs; nor after explantation with an older germ-band or a young embryo.3.Combination with two prospective diapause germs of equal age in a drop, having the same minor contamination ofNd-factors in the operation-cup, will result in a threefold increase of theNd-level as compared to the 1Tk-controls. The competence of the embryonic reaction system ranges from a coatlike germ-anlage to a germ with thoracic segmentation. In the dish-like germ-anlage at diapause onsetin ovo maximalNd-rate (70%) is foundin vitro, i.e. highest sensibility towardsNd-stimulatory factors. Also at this operative stage, bothTk of a drop, most frequently developed beyond the dormancy stage.4.Experiments with three prospective diapause germs of equal age in a drop, having the same minor contamination ofNd-factors in the operation-cup, show a sevenfold increase of theNd-level as compared to controls, showing an almost similar stage-range in competence and stage-specificity in sensibility. The increase of theNd-stimulation rate in relation with the number of test germs in the drop corresponds to a morphogenetic crowding-effect, the influence of the test germs on each other being called “interference”.5.Experiments with LYS-media which was slightly contaminated with bacteria and then refiltered had a 42%Nd-level in the 1Tk experiments. This significant difference from the 10% control level can be related to a sensitivity increasing factor or to aNd-stimulating “masterkey”-effect of the bacterial products in addition to the yolk factors already present. The 65%Nd-level in the 2Tk experiments clearly indicates “interference”.6.Interference was also shown inexperiments with artificially prospective non-diapause germ of the same age. Test-germs isolated immediately after the HCl-treatment had a very highNd-rate (78% in 2Tk and 100% in 3Tk). Interference also occurred in germ-bands that were removed at a later stage, i.e.in ovo prior to organogenesis (2Tk, 60%Nd-rate instead of 1Tk, 20%Nd-rate). Consequently, interference may be caused by a factor promoting an overall increase of tissue activity.7.Critical evaluation of the methods and discussion of the resultsin vitro permit the following conclusions as to the developmentin ovo. Up to organogenesis, the continuous development of the germ-anlage (non-dormancy), is stimulated by an extra-embryonic system. In particular, the yolk-cell system contains factors, without which all germ-bands (including nondiapausal eggs fromBombyx and presumably other insect eggs) can only pass autonomously through the already programmed and/or determined gastrulation and segmentation. In pre-determined egg-diapause, an extra-embryonic dormancy regulatory mechanism inactivates thisNd-action system. Maternal hormonal depots may influence the continuous stimulation of cell division and the information-transfer for the programming of organogenesis. The activation of enzyme-systems inNd-stimulation can be imitatedin vitro by bacterial contamination and by interference from test germs of the same age, and may be appear as increased sensibility of the test germs.ZusammenfassungEin nackter prospektiver Diapause-Keim (Keimanlage oder junger Keimstreif) hat in einem Fremdeiweißmedium (LYS) die Tendenz, sich nur bis zum vollsegmentierten Keimstreif (Dormanzstadium) zu entwickeln, kann aber von deponiertem Chorion-, Serosa- und Dottermaterialvia medium stimuliert werden, ohne Verzögerung die Organogenese zu durchlaufen (Nondormanz =Nd). Es blieb die Frage zu klären, ob ein Keim aus einem Nondiapause-Ei einen solchen Testkeim (Tk) beeinflussen kann, sich ununterbrochen weiterzuentwickeln. In Versuchen mit 2 verschiedenen und mit 2 oder 3 gleichen Keimen im hängenden Tropfen sowie mit einemTk allein (Kontrolle) sind Ergebnisse erzielt worden, die Rückschlüsse auf Kompetenz und Sensibilität des embryonalen Reaktionssystems, aber auch auf Faktoren des extraembryonalenNd-Aktionssystems in Eiern ohne und mit prädeterminiertem Diapause-Regulationsmechanismus gestatten.1.Kontrollexplantate (1 prospektiver Diapause-Tk inLYS) haben einenNd-Pegel von 10% (= Durchschnitt derNd-Raten in den Operationsstadien). Die Abweichung gegenüber früheren Kontrollversuchen (0%Nd) kann durch längere Operationszeit im Napf bei Versuchen mit mehreren Testkeimen erklärt werden. Etwa 7 min nach Öffnen des Eies muß mit einerNd-Stimulation durch Eireste im Operationsnapfvia LYS-medium gerechnet werden. Beim Umsetzen der Testkeime können vor allem aus dem Dottersystem stammende Substanzen, die amNd-Stimulationsprozeß beteiligt sind, in den hängenden Tropfen verschleppt werden. Gegen denNd-Kontrollpegel sind die Ergebnisse der kritischen Versuche mit minimalerNd-Stimulation statistisch gesichert worden.2.InVersuchen mit 2 verschiedenen Keimen imLYS-Tropfen läßt sich nicht ein Einfluß eines prospektiven Nondiapause-Keims (polyvoltin) auf einen prospektiven Diapause-Keim (univoltin) nachweisen. Auch im 2Tk- und 1Tk-Kontrollversuch haben diese natürlichen prospektivenNd-Keime die Tendenz sich nur bis zum Stadium des Dormanzkeimstreifs zu entwickeln. In der Kombination mit künstlichem prospektivenNd-Keim (univoltin, HCl-behandelt) wird der Testkeim nicht stimuliert; ebenso nicht, wenn er mit einem älteren Keimstreif oder mit einem jungen Embryo zusammen explantiert worden ist.3.InVersuchen mit 2 gleichalten prospektiven Diapause-Keimen im Tropfen zeigt sich bei der gleichen schwachen Kontamination mitNd-Faktoren im Operationsnapf ein dreimal so hoherNd-Pegel wie im 1Tk-Kontrollversuoh. Die Kompetenz des embryonalen Reaktionssystems reicht vom Stadium der mantelförmigen Keimanlage bis zu dem des Keimstreifs mit Segmentierung im Thorax. Die schüsseiförmige Keimanlage am Beginn der Eidiapausein ovo hatin vitro die maximaleNd-Rate (70%), d.h. die größte „Sensibilität“ gegenüber denNd-Stimulationsfaktoren. In diesem Operationsstadium haben sich auch am häufigsten beideTk eines Tropfens über das Dormanzstadium hinaus entwickelt.4.InVersuchen mit 3 gleichalten prospektiven Diapause-Keimen in einem Tropfen zeigt sich bei der gleichen schwachen Kontamination mitNd-Faktoren im Operationsnapf ein siebenmal so hoherNd-Pegel wie im Kontrollversuch, bei etwa gleicher Stadienbreite der Kompetenz und gleicher Stadienspezifität der Sensibilität. Die Erhöhung derNd-Stimulationsrate mit der Anzahl der Testkeime im Tropfen entspricht einem morphogenetischen crowding-effect; die gegenseitige Beeinflussung der Testkeime wird „Interferenz“ genannt.5.InVersuchen mit schwach bakterienkontaminiertem und wieder gefiltertemLYS-Medium ergab der Kontrollversuch (1Tk) 42%Nd-Pegel; der signifikante Unterschied gegenüber 10% Kontrollpegel muß auf einem die Sensibilität erhöhenden Faktor oder auf einemNd-stimulierenden Nachschlüssel der Bakterienprodukte zu den vorgegebenen Dotterfaktoren beruhen. Im 3Tk-Versuch zeigt sich mit 65%Nd-Pegel mit Sicherheit Interferenz der Testkeime.6.Interferenz läßt sich auch inVersuchen mit gleichalten künstlichen prospektiven Nondiapause-Keimen nachweisen. Gleich nach dem HCl-Schock im Schüsselkeim-Stadium isolierte Testkeime zeigen eine sehr hoheNd-Rate (2Tk, 78% und 3Tk, 100%). Später entnommene, also bereitsin ovo vor der Organogenese stehende Keimstreife zeigen ebenfalls Interferenz (2Tk, 60%Nd-Rate statt 1Tk, 20%Nd-Rate). Demnach würde die Interferenz auf einem allgemeinen die Gewebsaktivität erhöhenden Faktor beruhen.7.Kritik der Methodik und Diskussion der Befundein vitro haben folgende Schlußfolgerungen auf die Entwicklungin ovo ergeben. Die Keimanlage steht noch bis zur Organogenese unter dem Einfluß eines extraembryonalen Stimulationssystems für ständige Weiterentwicklung (Nondormanz). Vor allem das Dotterzellsystem besitzt Faktoren, ohne die jede Keimanlage, auch die in einem Nondiapause-Ei vonBombyx und wahrscheinlich auch in anderen Insekteneiern, nur die bereits programmierte Gastrulation und Segmentierung autonom ablaufen lassen kann. Bei prädeterminierter Eidiapause inaktiviert ein extraembryonaler Dormanz-Regulationsmechanismus dasNd-Aktionssystem. Bei der fortlaufenden Stimulation von Zellteilungen und der Übertragung von Informationen für die Programmierung der OrganogeneseSummary1.Naked germ-anlagen and germ-bands during segmentation from univoltine strains ofBombyx mori L. were used without HCl-treatment for culturein vitro. With improved methods germs could develop without their prospective diapause until they had finished organogenesis and if kept in hanging drops nearly one month. 5 culture mediums contained defined extracts: (1) eggs with prospective diapause germs, (2) eggs with nondiapausing germs (3) eggs with germbands in eudiapause, (4) eggs with embryos after diapause and (5) eggs with nondiapausing embryos. In every case explanted germs developed at least to fully segmented germbands (stage of dormancyin ovo) but often further.2.In culture medium (1), (2), (4), (5) 64–73% of germ-anlagen develop to embryos with articulate limbs and open backs, but in medium (3) only 55%. On the contrary germbands develop to this stage and to shortened embryos in medium (1) only to 38%, in (2) to 5%, in (3) to 12% but in (4) to 75% and in (5) even to 84%. In culture medium (3) there occur abnormal differentiations.3.A store of yolk or of yolk and serosa separately from the tested germ allows development in many more cases without dormancy and to small larvae with closed backs, with eye pigmentation and muscle contractions. Embryos with appendage formation grow to 100% in culture medium (4) with depositum. Therefore it is the most efficient medium for experiments with fragmented parts of a germ.4.The different rate of development without dormancy with germbands in culture medium (1) to (5) points to their competence for determining factors of diapause. One day diapausing germbands inovo arein vitro with yolk stores able to develop further. But 2 days old germs in dormancy also with stores cannot any further develop. The germband is definitively determined to eudiapause.5.Also the material in the stores can develop. Yolkcells may aggregate and will be enclosed by the serosa. Together they form bubbles which pulsate and yolk inside. This material could include factors for diapause, but also for basal metabolism and for syntheses of cell differentiation. Possibly it couldclean also the drop.6.The results invite discussions aboutin vitro methods, about the ability of the explanted germ for formation and about factors determining dormancy or organogenesis. The selected hypothesis requires experiments with a medium without egg-extract but with stores from extraembryonal egg-materials and it needs investigations of regulation in cell differentiation.

Morphogenetic movements and segmentation of posterior egg fragmentsin vitro

SummaryEggs ofCalliphora were operated (I) at the undifferentiated blastoderm stage, (II) after blastoderm differentiation and in the stages showing border furrows and the beginnings of gastrulation, and (III) during forward extension of the posterior germ band region along the dorsal egg surface. The operation consisted of cutting off up to 1/3 of the egg anteriorly and removing the posterior egg fragment from the vitelline membrane for culture in a hanging drop. As control experiments for the “explanted” egg fragments, anteriorly pricked eggs and corresponding posterior fragments not removed from the vitelline membrane were cultured in hanging drops. Different technical prerequisites for the sterile culture ofCalliphora embryo fragmentsin vitro were tested. Development of the living embryo fragments was followed, and representative embryos fixed and microscopically examined for comparison with normally developing embryos. In explants I cell formation in the blastoderm did not reach completion and the blastoderm nuclei did not divide further. Slight contractions of parts of the preblastoderm did occur, but no morphogenetic movements. —In control fragments cell formation mostly proceeded further, but gastrulation was abortive except in large fragments. In explants II, irregular immigration of mesoderm cells was possible in fragments explanted before mesoderm groove initiation, but the explants did not develop further. Invagination of mesoderm through a groove, followed by segmentation of the germ band and some differentiation, was possible only in explants operated after initiation of groove formation. The germ band did not extend antero-dorsally, but became folded laterally, these folds foreshadowing the intersegmental boundaries formed later. Organogenesis and histological differentiation were in many respects abnormal. — In contrast, mesoderm invagination and initiation of germ band extension were possiblein control fragments operated before mesoderm groove initiation, although abnormalities in gastrulation were common. Explants III, despite cessation of germ band extension after explantation, often underwent further development resulting in histologically differentiated partial embryos, showing various abnormalities in organogenesis. The dorso-lateral furrows often persisted until segmentation and may correspond to primitive intersegmental furrows. The hind-gut and part of the posterior mid-gut-rudiment often evaginated during germ band contraction. Only when avitelline membrane was present did the germ band continue to extend antero-dorsally and, although this extension was rarely complete, further development with normal organogenesis and histological differentiation took place.Of the three germ layers, the ectoderm most closely approached normal differentiation in both explants and control fragments, with differentiation of nerve ganglia, tracheae, salivary glands, and a hind-gut epithelium with Malpighian tubules. Differentiation of the mesoderm in the explants was confined to muscle fibres situated near the ganglia. The endoderm remained undifferentiated in explants but formed a mid-gut epithelium in some control fragments, when splanchnic mesoderm was also present.The bearings of these results on morphogenetic problems in the insect egg is discussed.ZusammenfassungEier vonCalliphora wurden (I.) im Vorblastodermstadium mit Polzellen, (II.) während der Differenzierung des Blastoderms und des Beginns der Primitivrinnenbildung und (III.) während des Schichtenbaues und der Streckung des Keimstreifs rückwärts auf die dorsale Eiseite operiert. Das Chorion wurde abgeschält, der Vorderpol bis zu 1/3 der Eilänge gekappt, und das Eifragment vorsichtig aus dem steifen sog. Dotterhäutchen ausgedrückt. Für die Weiterentwicklung wurden Steriltechnik, Kulturmedien und verschiedene Unterlagen im hängenden Tropfen erprobt. In den meisten Fällen war eine physiologische Salzlösung mit Zuckerzusatz und ein Stückchen Cellophanpapier benutzt worden. Als Kontrollversuche zur Entwicklung der „Explantate“ dienten vorn angestochene Eier und Posteriorfragmente mit ihrer Vitellinmembran, die zu gleicher Zeit und auf gleiche Weise im hängenden Tropfen kultiviert wurden. Der Entwicklungsablauf in vitro wurde am lebenden Objekt beobachtet und nach Fixierung in Schnittpräparaten lichtmikroskopisch ausgewertet.Kein Medium ist optimal gewesen. Junge Explantate werden etwas flacher und kleben an der Unterlage. Die Kontrollfragmente entwickeln sich im allgemeinen besser als die zugehörigen Explantate. Der Keim ragt manchmal aus der Vitellinmembranhülse heraus. Explantate des I. Operationsstadiums vermehren die Kerne nicht und vollenden nicht die Bildung der Zellgrenzen, sondern reduzieren sie. Geringe Kontraktionen des Eimaterials kommen vor, Gestaltungsbewegungen aber nicht. — InKontrollfragmenten schreitet die Bildung und Differenzierung des Blastoderms fort, die Gastrulationshewegungen werden in stark verkürzten Eiern abnorm. Explantate des II. Operationsstadiums entwickeln sich irregulär weiter, wenn sie noch nicht mit der Bildung der Primitivrinne begonnen hatten. Bei Beginn des Schichtenbaues operierte Eier können einen segmentierten Keimstreif bilden, der sich aber am Hinterpol nicht typisch dorsal wendet. Die Serosa ist oft geschwollen. Nicht unterlagertes Mesoderm bleibt bis auf eine kleine Portion untypischer somatischer Muskulatur nahe den Neuromeren undifferenziert. Die klaffenden Seitenplatten können sich zu Epidermis und Tracheen sowie zu je einem halben Nervensystem mit aufeinanderfolgenden Knotenpaaren differenzieren. Auch ohne Blastokinese können dorsolaterale Falten erscheinen, die mehr oder weniger deutlich in 4–5 ventrolaterale Segmentfurchen übergehen. Verspätet treten noch 1–2 Segmentanlagen vor der hinteren Entodermanlage auf. Das Einstülpen der hinteren Mitteldarmanlage und des Proktodaeum gelingt nicht. Schon die vor dem Auftreten der Primitivrinne operiertenKontrollfragmente können Schichtenbau, Segmentierung und Organdifferenzierung vollziehen, allerdings gelingt manchmal die Unterlagerung des Mesoderms nicht. Selbst ein normal ausgebildeter Keimstreif streckt sich in der Vitellinmembran-Hülse oft nicht mit einer Dorsalwendung des Hinterendes. Die dorsolateralen Falten sind oft irregulär oder fehlen ganz. Das Proktodaeum und eventuell ein Teil des Mitteldarmes werden manchmal ausgestülpt. Explantate des III. Operationsstadiums können sich bis zum schlupfreifen Zustand weiterentwickeln, aber das dorsal gewendete Keimstreifhinterende zieht sich etwas zurück. Allem Anschein nach entsprechen die dorsolateralen Falten primitiven Segmentfurchen. Das im ganzen dorsal gekrümmte Fragment verkürzt sich zur normalen Zeit vor der Ausbildung des Rückens. Der Enddarm hat sich oft nicht ein- sondern ausgestülpt. Auch bei denKontrollfragmenten kann das Hinterende sich nicht vollständig dorsal gestreckt haben. Im allgemeinen entwickeln sich die Kontrollen normal weiter.DasEktoderm differenziert sich in Fragmenten ohne und mit Dottermembran-Hülse ganz entsprechend dem Normalfall zu Epidermis, Nervenganglien, Tracheen, Speicheldrüsen und Enddarmepithel mit Malpighi-Gefäßen. DasMesoderm hat sich in Explantaten nur zu untypischen Muskelzügen differenziert, soweit es nahe den Ganglien liegt. DasEntoderm bleibt in Explantaten undifferenziert.Die Diskussion der morphogenetischen Probleme, zu deren Lösung diese Ergebnisse in vitro beitragen können, hat zu folgendenSchlußfolgerungen geführt. Die Anteriorschnittversuche erlauben noch nicht, einen blastodermalen Anlagenplan abzuleiten. Der Innendruck des Eies ist nicht eine entscheidende Bedingung für normale Weiterentwicklung. Die Begrenzung des Eiraumes durch das Dotterhäutchen ist wichtig für die Gestaltungsbewegungen bei der Bildung der Zellmembranen des Blastoderms, beim Schichtenbau und beim Dorsalwenden des sich streckenden Keimstreifendes. Dynamische Faktoren für den Beginn der Gastrulation sind weniger im Dotterentoplasmasystem als in den Blastodermzellen zu suchen. Abnorme Gestaltungsbewegungen werden begleitet von abnormer Zellformung. Das Ektoderm ist selbstdifferenzierungsfähig; abortiv gastruliertes Mesoderm kann sich nur in der Nachbarschaft von Ganglienmaterial zu Muskelanlagen differenzieren. Die Proktodaealanlage kann sich nur im dorsal gestreckten Keimstreif richtig einstülpen. Mesoderminvagination ist eine Vorbedingung für die Segmentierung des Keimstreifs. Dorsolaterale Querfalten können in Explantaten auch ohne dorsale Keimstreifstreckung entstehen. Sie gehen auch oft, wenn sie schon beim Explantieren angedeutet sind, in ventrolaterale primitive Segmentgrenzen über, die anscheinend zwischen Paaren aufeinanderfolgender, definitiver Segmentanlagen einfurchen. Die Verkürzung des segmentierten Keimstreifs erfolgt unabhängig von der Vitellinmembranwand.