Gudrun Laskawy

Co-oxidation of carotene and crocin by soyabean lipoxygenase isoenzymes

ZusammenfassungDrei in Sojabohnen vorkommende Lipoxygenasen wurden chromatographisch getrennt: L-1 (pH-Optimum 9,0), L-2 (pH 6,5), L-3 (pH 6,5). Gemessen wurden die Geschwindigkeiten mit denen diese Enzymeβ-Carotin oder Crocin in Gegenwart von Linolsäure oder Linoleylsulfat co-oxydieren. Die Carotinoid-Umsätze wurden auf die jeweilige Lipoxygenase-Aktivität bezogen.β-Carotin/Linolsäure: 55% (L-2), 43% (L-3), 6% (L-1), Crocin/Linolsäure: 17,8% (L-2),14,3% (L-3),3,3% (L-1), Crocin/Linoleylsulfat: 24% (L-3), 4,2% (L-1).Für die Crocin-Bleichung wurde die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Enzym-, Crocin- und Linolsäure-Konzentration bestimmt.Zur Erklärung der Unterschiede zwischen den pH 6,5- (L-2, L-3) und der alkalischen Lipoxygenase (L-1) wird angenommen: L-2 und L-3 bilden besonders aktiv Radikale, welche die Polyene co-oxydieren können. Beide Enzyme besitzen in der Nähe des aktiven Zentrums eine hydrophobe Bindungsstelle für dasβ-Carotin.SummaryThree lipoxygenases that occur in soya beans were separated chromatographically. L-1 (optimum pH = 9.0), L-2 (pH 6.5), L-3 (pH 6.5). The velocities with which these enzymes co-oxidiseβ-carotene or Crocin in the presence of linoleic acid or linoleyl sulphate weremeasured. The carotenoid turnover was related to each lipoxygenase activity.β-carotene/linoleic acid = 55% (L-2), 43% (L-3), 6% (L-1), Crocin/linoleic acid = 17,8% (L-2), 14,3% (L-3), 3.3% (L-1), crocin/linoleyl sulphate = 24% (L-3), 4,2% (L-1).The relationship between the reaction rate of the Crocin bleaching and the concentrations of the enzyme, Crocin and linoleic acid was determined. To explain the differences between the pH-6.5 (L-2, L-3) and the alkaline (L-1) lipoxygenases it is supposed that L-2 and L-3 form specially active radicals that are able to co-oxidise polyenes. Both enzymes possess a hydrophobic bonding position, in the neighbourhood of the active site, forβ-carotene.

Co-oxidation of carotenes requires one soybean lipoxygenase isoenzyme.

The type II lipoxygenase (optimum pH 6.5) from soybeans was purified and separated into two fractions either by chromatography on DEAE-Sephadex or by isoelectric focusing. In the presence of linoleic acid and oxygen both fractions co-oxidise canthaxanthine or beta-carotene as effectively as a combination of these fractions. Oxygenation of linoleic acid and co-oxidation of canthaxanthine by type II lipoxygenase is stimulated by 13-hydroperoxy-cis-9,trans-11-octadecadienoic acid but not by 13-hydroxy-cis-9,trans-11-octadecadienoic acid or 9-hydroperoxy-trans-10,cis-12-octadecadienoic acid.

Quantitative Analyse von Autoxidationsprodukten des Cholesterols in tierischen Lebensmitteln Quantitative Analysis of the Autoxidation Products of Cholesterol in Foods of Animal Origin

After extraction with methylene chloride, isolation of the unsaponifiable lipid fraction and enrichment by two-step column chromatography, the oxycholesterols were gas chromatographically separated in the form of their trimethylsilyl ethers on a thin film capillary and identified by mass spectrometry. The three major products of cholesterol autoxidation were cholest-5-en-3 beta, 7 alpha-diol(I) its 7 beta-epimer(II) and 5,6-epoxy-cholestan-3 beta-ol(III). In addition, traces of cholestan-3 beta, 5 alpha, 6 beta-triol and cholest-5-en-3 beta,25-diol were detected in some samples. Quantitative analysis was performed with cholest-5-en-3 beta,19-diol as internal standard. The highest concentrations of I-III were found in spray dried egg powders (total amount 15-60 micrograms/g). Parmesan cheese, butter oil and sausages contained significantly lower levels of I-III (total amount 0.1-2.6 micrograms/g). The concentrations of I-III increased strongly when butter oil and beef tallow were heated at 170 degrees C in the presence of air for a longer period.SummaryAfter extraction with methylene chloride, isolation of the unsaponifiable lipid fraction and enrichment by two-step column chromatography, the oxycholesterols were gas chromatographically separated in the form of their trimethylsilyl ethers on a thin film capillary and identified by mass spectrometry. The three major products of cholesterol autoxidation were cholest-5-en-3β,7α-diol(I) its 7β-epimer(II) and 5,6-epoxy-cholestan-3β-ol(III). In addition, traces of cholestan-3β,5α,6β-triol and cholest-5en-3β,25-diol were detected in some samples. Quantitative analysis was performed with cholest-5-en-3β,19-diol as internal standard. The highest concentrations of I-III were found in spray dried egg powders (total amount 15–60 μg/g). Parmesan cheese, butter oil and sausages contained significantly lower levels of I-III (total amount 0.1–2.6 μ/g/g). The concentrations of I-III increased strongly when butter oil and beef tallow were heated at 170 °C in the presence of air for a longer period.[/p]ZusammenfassungNach Extraktion mit Methylenchlorid und Isolierung der unverseifbaren Lipid-Fraktion wurden die Oxycholesterole über zwei säulenchromatographische Schritte angereichert und dann als Trimethylsilylether gaschromatographisch an Dünnfilmcapillaren getrennt und massenspektrometrisch identifiziert. Als Hauptprodukte wurden Cholest-5-en-3β,7α-(I) und 7β-diol(II) sowie das 5,6-Epoxy-cholestan-3β-ol(III) und in einigen Proben Spuren von Cholestan-3β,5α,6β-triol und Cholest-5-en-3β,25-diol identifiziert. Quantitative Analysen wurden nach Zusatz von Cholest-5-en-3β,19-diol als interner Standard durchgeführt.Sprühgetrocknete Eipulver enthielten die höchsten Konzentrationen von I-III (insgesamt 15-60 μg/g). Im Parmesankäse, Butterschmalz und bei Wurst proben lagen die Konzentrationen von I-III wesentlich niedriger (insgesamt 0,1-2,6 gg/g). Wurde Butterschmalz oder Talg unter Luftzutritt auf 170 °C längere Zeit erhitzt, so nahmen I-III stark zu.[/p]

Determination of free reduced and total glutathione in wheat flours by an isotope dilution assay

ZusammenfassungEine Isotopenverdünnungsanalyse (IVA) wurde für das freie reduzierte (GSH) und das gesamte Glutathion (GSH, GSSG proteingebundenes Glutathion) entwickelt und auf seine Genauigkeit und Empfindlichkeit überprüft. Die neue Methode für GSH erfordert die Extraktion der Mehlprobe mit einem Puffer bei pH 4,5, der N-Ethylmaleinsäureimid (NEMI) und [14C]-GS-NEMI enthält, Reinigung des markierten und unmarkierten GS-NEMI durch drei chromatographische Schritte sowie die Bestimmung der spezifischen Radioaktivität von dem isolierten GS-NEMI. Das gesamte Glutathion wird nach Reduktion mit Dithioerythrit bestimmt. Anwendungen der IVA zeigten, daß die Konzentrationen von GSH (16 bis 41 nmol) und von gesamtem Glutathion (170 bis 185 nmol/g) relativ gering waren in Mehlen mit niedrigen Aschegehalten, aber daß sie mit steigendem Ausmahlungsgrad zunahmen. Die GSH-Konzentration war in einem Mehl höher, das aus Körnern stammte, die in Abwesenheit von Sauerstoff gemahlen worden waren. Die Lagerung von Mehlen erniedrigte den GSH-Gehalt. Die IVA von Mehlfraktionen zeigte, daß der Extraktionsrückstand, der hauptsächlich aus Stärke und Glutelinen bestand, das meiste gebundene Glutathion enthielt.SummaryAn isotope dilution assay (IDA) for free reduced glutathione (GSH) and total glutathione (GSH, oxidised glutathione and protein-bound glutathione) was developed and its accuracy and sensitivity were established. The new method for GSH required extraction of flour samples with a buffer at pH 4.5 containingN-ethyl maleimide (NEMI) and14C-labelled S-(N-ethylsuccinimido) glutathione ([14C]GS-NEMI), purification of the labelled and unlabelled GS-NEMI by three Chromatographic steps and assay of the specific radioactivity of the GS-NEMI isolated. Total glutathione was assayed after reduction with dithioerythritpl. Applications of the IDA indicated that the levels of GSH (16–41 nmol/g) and total glutathione (170–185 nmol/g) were relatively low in flours with low ash contents, but increased with increasing extraction grade. The level of GSH was higher in a flour obtained from kernels that were ground in the absence of gaseous oxygen. Storage of flours reduced the GSH concentration. IDA of fractions obtained from flour showed that the extraction residue, mainly consisting of starch and glutelins, contained most of the bound glutathione.

Influence of glutathione and cysteine on the improver effect of ascorbic acid stereoisomers

The effects of the four ascorbic acid (AA) stereoisomers on the rheology of flour-water doughs were determined using a micro-scale extension test. L -Threo-AA had the greatest dough strengthening effect, both D -and L -erythro-AA were less active, and D -threo-AA was inactive. This ranking was not changed by addition of reduced glutathione (GSH) or cysteine (Cys), and it corresponds to the substrate specificity of the glutathione dehydrogenase (GSH-DH) enzyme occurring in wheat. Variation in the concentrations of the thiols revealed that Cys lowered the improver effect of L -threo-AA more than GSH. Gluten was isolated, in the presence of air and in a nitrogen atmosphere, from flour-water doughs that were mixed in air with and without L -threo-AA. The improver effect was more apparent for gluten-N2 than for gluten-air. The results support the hypothesis that the improving effect of L -threo-AA is due, at least in part, to the function of L -threo-DHAA in the oxidation of GSH catalysed by GSH-DH.

Comparison of sensitizers in the photooxidation of unsaturated fatty acids and their methyl esters

ZusammenfassungBei der sensibilisierten Photooxidation von Methyloleat und Methyllinoleat bildeten die Phaeophytinea undb mehr Hydroperoxide als die Chlorophyllea undb. Der Unterschied beruht auf einer erhöhten Stabilität der Phaeophytine bei der Photooxidation. Die Analyse der Monohydroperoxid-Isomeren bestätigte, daß es sich bei diesen Pflanzenfarbstoffen um Sensibilisatoren handelt, die Singulett-Sauerstoff bilden. Riboflavin in Methanol und Curcumin in Benzol wurden zusätzlich als Typ-II-Sensibilisatoren identifiziert. Bei der durch Riboflavin sensibilisierten Photooxidation von Ölsäure, emulgiert in Wasser, wurde neben der Oxidation durch Singulett-Sauerstoff noch eine Autoxidation nachgewiesen. Chloranil produzierte überwiegend Singulett-Sauerstoff, initiierte aber daneben eine Autoxidation von Methyloleat und Linolensäure, gelöst in Benzol. Die HPLC-Analyse der Hydroperoxid-Isomeren nach Hydrierung und Überführung der Hydroxystearinsäuren in Phenacylester wurde als eine empfindliche Methode angewendet zur Unterscheidung zwischen Autoxidation und Oxidation durch Singulett-Sauerstoff.SummaryDuring the photosensitized oxidation of methyl oleate and methyl linoleate the phaeophytinsa andb were more effective than the chlorophyllsa andb in producing hydroperoxides. This difference can be ascribed to the superior stability of the phaeophytins. Analysis of the monohydroperoxide isomers confirmed that these plant pigments act as sensitizers that produce singlet oxygen. Riboflavin in methanol and curcumin in benzene were also identified as type II sensitizers. During a riboflavin sensitized photooxidation oleic acid emulsified in water underwent some autoxidation in addition to oxidation by singlet oxygen. Chloranil produced singlet oxygen but was also able to initiate some autoxidation of methyl oleate and linolenic acid dissolved in benzene. HPLC analysis of the monohydroperoxide isomers after hydrogenation and conversion of the hydroxystearic acids to phenacyl esters was used as a sensitive method to distinguish between autoxidation and oxidation by singlet oxygen.

[Co-oxidation of beta-carotene and canthaxanthine by purified lipoxygenases from soya beans (author's transl)].

SummaryIsolation and purification of soya bean lipoxygenase (linoleate: O2 oxidoreductase, EC, 1.13.11.12) on Sephadex G-200, DEAE-cellulose and by isoelectric focusing yields two isoenzymes of the L-2 type (optimum pH 6.5) and two of the L-1 type (optimum pH 9.0). Different crude extracts from soya beans as well as the purified L-2 isoenzymes exhibit the same capacity for co-oxidation ofβ-carotene and canthaxanthine, when the comparison is based upon equal lipoxygenase activities. In contrast to L-2 the alkaline lipoxygenase L-1 is a poor „carotene oxidase”.ZusammenfassungDie Isolierung und Reinigung der Sojabohnen-Lipoxygenase (Linolsdure: O2 Oxydoreduktase EC 1.13.11.12) an Sephadex G-200, DEAE-Cellulose und durch isoelektrische Fokussierung ergab zwei Isoenzyme vom L-2-Typ (pH-Optimum 6,5) und zwei von L-1-Typ (pH-Optimum 9,0). Verschiedene Rohextrakte aus Sojabohnen und die gereinigten L-2-Isoenzeyme besaßen dieselbe Co-Oxydations-Kapazität gegenüberβ-Carotin und Canthaxanthin. Im Unterschied dazu ist die alkalische Lipoxygenase L-1 eine schwache „Carotin-Oxydase”.

Untersuchungen über die Beteifigung von Linolsäure am Bittergeschmack von Mohnsamen (Papaver somniferum)

SummaryIn lipids isolated from poppy seeds which tasted “burning-bitter” the off-taste was associated with the free fatty acids fraction. In this fraction linoleic acid predominates, while oxidized fatty acids were among the minor constituents. The taste threshold of linoleic acid emulsified in water with monolinolein lies in the range of 4.0–6.0 μmol/ml. On the basis of its high concentration and relatively low taste threshold we conclude that free linoleic acid contributes significantly to the “burning-bitter” off-taste in poppy seeds.ZusammenfassungIn den Lipiden, die von Blaumohn, der „brennend-bitter” schmeckte, isoliert worden waren, wurden die Bitterstoffe in der Fraktion der freien Fettsäuren lokalisiert. Diese Fraktion enthielt überwiegend Linolsäure und daneben oxidierte Fettsäuren als Minorkomponenten. Die Geschmacksschwelle von Linolsäure, emulgiert in Wasser mit Monolinolein, liegt im Bereich von 4,0–6,0 μmol/ml. Auf Grund der hohen Konzentration und der relativ niedrigen Geschmacksschwelle wird geschlossen, daß Linolsäure am „brennend-bitteren” Geschmacksfehler bei Mohnsamen sehr wesentlich beteiligt ist.

Enzymatischer Carotinabbau in Erbsen, Sojabohnen, Weizen und Leinsamen

SummaryExtracts from peas, soy beans, wheat and flax seed were separated by gel or ion-exchange chromotography. The carotene-bleaching-activity was tested in the eluates: The lipoxygenase isoenzymes with a pH optimum of 6,5 are very potent carotene oxidases if linoleic acid is present in the incubation medium. Such carotene oxidases occur in peas, soy beans and wheat. —In contrast the alcaline lipoxygenase isoenzyme from soy beans, the hydroperoxide isomerase from flax seed and the peroxydases from wheat and soy beans are very poor carotene oxydases. The carotene-bleaching activity of the pH 6,5 lipoxygenases was inhibited by NDGA. During the test on carotene oxydases activity the carotene was not oxidized by the linoleic acid hydroperoxides.ZusammenfassungExtrakte aus Erbsen, Sojabohnen, Weizen und Leinsamen wurden durch Gel- oder Ionenaustauschchromatographie getrennt. Die Bestimmung der Carotin-Abbau-Aktivität der Eluate ergab: Die Lipoxygenase-Isoenzyme mit einem pH-Optimum bei 6,5 sind sehr wirksame Carotinoxydasen, wenn Linolsäure im Incubationsansatz vorhanden ist. Solche Carotinoxydasen kommen in Erbsen, Sojabohnen und im Weizen vor. Im Unterschied dazu bauen die alkalische Lipoxygenase aus Sojabohnen, die Hydroperoxidisomerase aus Leinsamen und die Peroxidasen aus Weizen und Sojabohnen nur sehr langsam das Carotin ab. Gehemmt wird die Carotin-Bleichung der pH 6,5-Lipoxygenasen durch NDGA. Linolsäurehydroperoxide oxydieren nicht das β-Carotin während der Bestimmung der Carotinoxydase-Aktivität.

Positions-Spezifität der Peroxidierung von Linol- und Linolensäure durch Homogenate aus Äpfeln und Birnen

SummaryHomogenates of apples and pears were incubated (25° C, 20 min), with linoleic and linolenic acid. The major products were fatty acid hydroperoxides. The ratio of 13- to 9-hydroperoxides were at least 82:18 in favour of the 13-isomer for apples and 10:90 in favour of the 9-isomer for pears. The significance of the results for the formation of flavour compounds in apples and pears is discussed.ZusammenfassungHomogenate aus Äpfeln und Birnen wurden mit Linol- und Linolensdure incubiert (25° C, 20 min). Die Hauptprodukte waren Fettsäurehydroperoxyde. Die molaren Anteile, mit denen 13-und 9-Hydroperoxyde gebildet wurden, betrugen bei Äpfeln 82:18 (zu Gunsten des 13-lsomeren) und bei Birnen 10:90 (zu Gunsten des 9-Isomeren). Die Bedeutung der Ergebnisse für die Bildung von Aromastoffen in Äpfeln und Birnen wird diskutiert.Homogenates of apples and pears were incubated (25 degrees C, 20 min) with linoleic and linolenic acid. The major products were fatty acid hydroperoxides. The ratio of 13- to 9-hydroperoxides were at least 82:18 in favour of the 13-isomer for apples and 10:90 in favour of the 9-isomer for pears. The significance of the results for the formation of flavour compounds in apples and pears is discussed.