H. G. Schlegel

Biodegradation of polyhydroxyalkanoic acids.

Abstract Stimulated by the commercial availability of bacteriologically produced polyesters such as poly[(R)-3-hydroxybutyric acid], and encouraged by the discovery of new constituents of polyhydroxyalkanoic acids (PHA), a considerable body of knowledge on the metabolism of PHA in microorganisms has accumulated. The objective of this essay is to give an overview on the biodegradation of PHA. The following topics are discussed: (i) general considerations of PHA degradation, (ii) methods for identification and isolation of PHA-degrading microorganisms, (iii) characterization of PHA-degrading microorganisms, (iv) biochemical properties of PHA depolymerases, (v) mechanisms of PHA hydrolysis, (vi) regulation of PHA depolymerase synthesis, (vii) molecular biology of PHA depolymerases, (viii) influence of the physicochemical properties of PHA on its biodegradability, (ix) degradation of polyesters related to PHA, (x) biotechnological aspects of PHA and PHA depolymerases.

Die Carotinoide der Thiorhodaceae

ZusammenfassungEs werden Isolierung und Eigenschaften eines neuen Carotinoids beschrieben. Es liegt in Chromatium okenii als einziges Carotinoid vor, ist in relativ sehr hoher Konzentration (50 μg/mg Protein) enthalten und durch eine konjugierte Ketogruppe und eine tertiäre Methoxylgruppe charakterisiert. Es wird der Name “Okenon” vorgeschlagen. Phytofluen, ξ-Carotin, Neurosporin und Lycopin wurden als Begleitcarotinoide lediglich in Zellen nachgewiesen, die in Gegenwart von Diphenylamin gewachsen waren.SummaryIsolation and properties of a new carotenoid are described. It was found in Chromatium okenii as the only carotenoid in a remarkably high concentration (50 μg/mg protein) and is characterized by the presence of a conjugated keto-group and a tertiary methoxyl-group. We suggest to name the new carotenoid okenone. Phytofluene, ξ-carotene, neurosporene and lycopene were found only in cells grown in the presence of diphenylamine.

Clostridium formicoaceticum nov. spec. isolation, description and distinction from C. aceticum and C. thermoaceticum.

ZusammenfassungClostridium formicoaceticum wird als eine neue Art beschrieben. Es vergärt Fructose und eine Reihe von Hexon- und Hexuronsäuren zu Acetat und Formiat. Während des Wachstums wird hauptsächlich Acetat gebildet; größere Mengen von Formiat erscheinen unter den Gärungsendprodukten erst in der stationären Wachstumsphase. C. formicoaceticum ist mesophil. Es unterscheidet sich von C. aceticum durch sein Unvermögen, mit Wasserstoff und Kohlendioxid zu wachsen. Weiterhin kann molekularer Wasserstoff auch in Gegenwart einer organischen Energiequelle von C. formicoaceticum nicht für die Acetatsynthese genutzt werden.SummaryA new species—Clostridium formicoaceticum—is described. It ferments fructose and several hexonic and hexuronic acids to acetate and formate. During active growth acetate is the main product of the fermentation. Considerable quantities of formate appear among the fermentation products in the stationary growth phase. C. formicoaceticum is mesophilic. It differs from C. aceticum in its inability to grow on hydrogen plus carbon dioxide. Furthermore, hydrogen gas does not stimulate acetate production even in the presence of organic energy sources.

Purification, some properties and quaternary structure of thed-ribulose 1,5-diphosphate carboxylase ofAlcaligenes eutrophus

Abstractd-Ribulose 1,5-diphosphate carboxylase has been purified from autotrophically grown cells of the facultative chemolithotrophic hydrogen bacteriumAlcaligenes eutrophus. The enzyme was homogeneous by the criteria of polyacrylamide gel electrophoresis. The molecular weight of the enzyme was 505000 determined by gel filtration and sucrose density gradient centrifugation, and a sedimentation coefficient of 18.2 S was obtained. It was demonstrated by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis that the enzyme consists of two types of subunits of molecular weight 52000 and 13000.Electron microscopy on the intact and the partially dissociated enzyme lead to the construction of a model for the quaternary structure of the enzyme which is composed of 8 large and 8 small subunits. The most probable symmetry of the enzyme molecule is 4:2:2.Michaelis constant (Km) values for ribulose 1,5-diphosphate, Mg2-, and CO2 were 0.59 mM, 0.33 mM, and 0.066 mM measured under air. Oxygen was a competitive inhibitor with respect to CO2 suggesting that the enzyme also exhibits an oxygenase activity. The oxygenolytic cleavage of ribulose 1,5-diphosphate was shown and a 1:1 stoichiometry between oxygen consumption and 3-phosphoglycerate formation observed.

Verwertung von Fructose durch Hydrogenomonas H16 (I.)

ZusammenfassungDie Hydrogenomonas-Stämme H 1, H 16 und H 20 nutzen als einziges Kohlenhydrat Fructose; chemolithotroph gewachsene Zellen des Stammes H 16 oxydieren diesen Zucker nach einer lag-Phase von 20 min.Die Fructose wird über den Entner-Doudoroff-Weg umgesetzt; während der Adaptation erhöht sich der Gehalt der Zellen an Phosphoglucose-Isomerase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und an den für den Entner-Doudoroff-Weg charakteristischen Enzymen.Die Aktivität der Ribulosediphosphat-Carboxylase geht bei der Adaptation an Fructose innerhalb von 2 Std um 75% zurück, sinkt dann aber während mehrerer Fructose-Passagen nur langsam ab. Folglich kann selbst mit Fructose gewachsener Hydrogenomonas H 16 Kohlendioxyd über den Calvin-Cyclus fixieren.SummaryThe only carbohydrate utilized by Hydrogenomonas strains H 1, H 16 and H 20 is fructose; chemolithotrophically grown cells of strain H 16 oxidize this sugar following a lag-period of 20 min. Fructose is metabolized via the Entner-Doudoroff-pathway. During the adaptation to fructose, the level of the following enzymes increases in the cells: phosphoglucoseisomerase, glucose-6-phosphate-dehydrogenase and the enzymes characteristic of the Entner-Doudoroff-pathway.During the change from chemolithotrophic to organotrophic growth, with fructose serving as a substrate, the activity of ribulose-diphosphate carboxylase is reduced by 75% within 2 hrs. However, following repeated growth in a fructose medium, this enzyme activity decreases only very slowly. Consequently fructose-grown Hydrogenomonas H 16 is capable of fixing carbon dioxide via the Calvin cycle.

Regulation der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aus Hydrogenomonas H 16 durch ATP und NADH2

Summary1.In Hydrogenomonas H 16 the synthesis of the enzymes of the Entner-Doudoroff (ED)1 degradative pathway is repressed by molecular hydrogen. In fully induced cells grown on fructose the utilization of fructose is inhibited. This inhibition results in a decrease of the rates of growth of formation of poly-β-hydroxybutyric acid by 80%. This inhibition exerted in vivo by hydrogen is probably due to an inhibition of glucose-6-phosphate (G-6-P) dehydrogenase by metabolites.2.G-6-P-dehydrogenase has been purified from extracts of Hydrogenomonas H 16 ca. 100-fold. It differs from the yeast enzyme by a low substrate affinity, by a specificity for both NADP and NAD and by a sigmoid substrate saturation curve (G-6-P).3.The enzyme is inhibited by ATP and NADH2. The sigmoidity of the substrate saturation curve (G-6-P) is increased by ATP. From kinetic data the following conclusions may be drawn: a) the inhibition by NADH2 is mainly caused by competition between NADP and NADH2 for the binding site of the coenzymes at the enzyme; b) G-6-P-dehydrogenase is an allosteric enzyme which is composed of at least four subunits; ATP is a negative allosteric effector; c) the binding sites of the subunits for the substrate show cooperative interactions; d) the enzyme fits the “K-system”, i.e. the allosteric effector changes the apparent Km-value without influencing the maximal velocity (vmax) of enzyme action.4.The enzyme is more or less strongly inhibited by all nucleoside triphosphates tested as well as by ADP. The inhibitory effect of AMP and other nucleoside monophosphates is negligibly low. A positive effector has not been found.5.The enzyme from H 16 is not activated by magnesium ions. High magnesium concentrations are even inhibitory. The inhibition caused by ATP can be completely releaved by magnesium sulfate, if G-6-P is present in quasi saturating concentration. The inhibitory effect becomes minimal when the ratio Mg/ATP exceeds 1.3.Zusammenfassung1.Die Bildung der zum Fructoseabbau über den Entner-Doudoroff-Weg dienenden Enzyme wird in Hydrogenomonas H 16 durch molekularen Wasserstoff reprimiert. In volladaptierten, auf Fructose gewachsenen Zellen wird der Fructoseabbau durch H2 gehemmt. Die durch H2 bewirkte Hemmung greift wahrscheinlich an der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase an.2.Die aus Hydrogenomonas H 16 100fach angereicherte Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase unterscheidet sich vom Hefeenzym durch ihre geringe Substrataffinität, durch die Fähigkeit sowohl mit NADP als auch mit NAD als Coenzym zu reagieren und durch den sigmoiden Verlauf der Substratsättigungskurve (G-6-P).3.Das Enzym wird durch ATP und NADH2 gehemmt. Durch ATP wird die Sigmoidität der Substratsättigungskurve verstärkt. Aus den gewonnenen kinetischen Daten ist zu schließen, a) daß die durch NADH2 bewirkte Hemmung vor allem auf einer Konkurrenzreaktion zwischen NADP und NADH2 um die Bindungsstelle des Coenzyms am Enzym beruht, b) daß G-6-P-DH ein allosterisches Enzym ist, das aus mindestens vier Untereinheiten besteht und für welches ATP ein negativer allosterischer Effector ist; c) daß die Substratbindungsstellen für G-6-P der Enzymuntereinheiten kooperative Wechselwirkungen aufeinander ausüben; d) daß G-6-P-DH ein “K-System”, ist, d. h. daß der allosterische Effector den apparenten Km-Wert,jedoch nicht die maximale Geschwindigkeit (vmax) der Enzymfunktion verändert.5.G-6-P-DH aus H 16 wird durch Magnesium-Ionen nicht aktiviert. Hohe MgSO4-Konzentrationen hemmen das Enzym sogar. Durch Zusatz von MgSO4 kann die “ATP-Hemmung” vollkommen aufgehoben werden, wenn G-6-P in hoher Konzentration im Reaktionsgemisch vorliegt. Die Hemmung wird minimal, wenn das Verhältnis Mg/ATP den Wert 1,3 übersteigt.1. Die Bildung der zum Fructoseabbau uber den Entner-Doudoroff-Weg dienenden Enzyme wird in Hydrogenomonas H 16 durch molekularen Wasserstoff reprimiert. In volladaptierten, auf Fructose gewachsenen Zellen wird der Fructoseabbau durch H2 gehemmt. Die durch H2 bewirkte Hemmung greift wahrscheinlich an der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase an. 2. Die aus Hydrogenomonas H 16 100fach angereicherte Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase unterscheidet sich vom Hefeenzym durch ihre geringe Substrataffinitat, durch die Fahigkeit sowohl mit NADP als auch mit NAD als Coenzym zu reagieren und durch den sigmoiden Verlauf der Substratsattigungskurve (G-6-P). 3. Das Enzym wird durch ATP und NADH2 gehemmt. Durch ATP wird die Sigmoiditat der Substratsattigungskurve verstarkt. Aus den gewonnenen kinetischen Daten ist zu schliesen, a) das die durch NADH2 bewirkte Hemmung vor allem auf einer Konkurrenzreaktion zwischen NADP und NADH2 um die Bindungsstelle des Coenzyms am Enzym beruht, b) das G-6-P-DH ein allosterisches Enzym ist, das aus mindestens vier Untereinheiten besteht und fur welches ATP ein negativer allosterischer Effector ist; c) das die Substratbindungsstellen fur G-6-P der Enzymuntereinheiten kooperative Wechselwirkungen aufeinander ausuben; d) das G-6-P-DH ein “K-System”, ist, d. h. das der allosterische Effector den apparenten K m -Wert,jedoch nicht die maximale Geschwindigkeit (vmax) der Enzymfunktion verandert. 5. G-6-P-DH aus H 16 wird durch Magnesium-Ionen nicht aktiviert. Hohe MgSO4-Konzentrationen hemmen das Enzym sogar. Durch Zusatz von MgSO4 kann die “ATP-Hemmung” vollkommen aufgehoben werden, wenn G-6-P in hoher Konzentration im Reaktionsgemisch vorliegt. Die Hemmung wird minimal, wenn das Verhaltnis Mg/ATP den Wert 1,3 ubersteigt.

N2-fixation by chemoautotrophic hydrogen bacteria.

The Gram-positive coryneform bacteria strains 14g and 7C were found to be able to grow with N2 as sole nitrogen source when incubated under microaerobic conditions. Nitrogenase activity in whole cells was assayed by acetylene reduction. High rates of ethylene production (50–120 nmole/hxmg cell protein) were observed in N2 or glutamate grown cell suspensions shaken in an atmosphere of 2.5% O2, 10% acetylene and 87.5% argon.

Taxonomic Studies on Some Gram-Positive Coryneform Hydrogen Bacteria

Recently isolated coryneform hydrogen bacteria were investigated under taxonomical aspects. Strains 7 C, RH 10, and 14 g are characterized by the snapping type of cell division, 68.5 to 69.7% GC content, dl-diaminopimelic acid in the cell wall, content of metachromatic granules, weak utilization of sugars and inhibitory effect of citrate. The strains are placed to the group 1—genus Corynebacterium—of the classification of coryneform bacteria of Yamada and Komagata (1972) and the name Corynebacterium autotrophicum sp.nov. is proposed.Strains 11 X and RH 12 are characterized by the bending type of cell division, a GC content of 70.2 and 70.5%, ll-diaminopimelic acid in the cell wall, absence of metachromatic granules, utilization of several sugars and no changes in cell morphology by citrate. The strains have to be placed to group 6 of coryneform bacteria.

Chemolithotrophes Wachstum von Hydrogenomonas H16 im Chemostaten mit elektrolytischer Knallgaserzeugung

SummaryA chemostat for growing Knallgasbacteria with limiting concentrations of hydrogen or oxygen is described. Both gaseous components were produced by electrolysis of the mineral medium. By using two anodes, one of which was located outside the culture vessel, the proportion of hydrogen and oxygen could be varied within wide limits. An electronic control unit consisting of a magnetic valve, a drop counter with platinum contacts and a timer was used to control and vary the flowrate from 20 to 720 ml/hour.When Hydrogenomonas H 16 was grown with limiting hydrogen or oxygen concentrations in static culture, the rate of gas uptake and hydrogenase activity of the cells declined concomitantly. In continuous culture with hydrogen as the growth limiting factor, the relationships between growth, cell density and hydrogen consumption were investigated. At equal growth rates some metabolic activities were compared. With hydrogen as the limiting factor, the amount of poly-β-hydroxy-butyric acid was negligable, however, the specific activities of hydrogenase and glyceraldehyde phosphate dehydrogenase were high. With oxygen as the limiting factor the cells accumulated poly-β-hydroxybutyric acid up to 23% of the dry weight; the activities of hydrogenase and glyceraldehyde phosphate dehydrogenase were low. The H2/CO2-ratio was 9.1 with hydrogen limitation and 4.6 with oxygen limitation. The specific activities of other enzymes (phosphoglycerokinase, NADP-specific glutamate-dehydrogenase) did not significantly differ under either condition.ZusammenfassungEin Chemostat zur Kultur von Knallgasbakterien mit begrenzenden Konzentrationen von Wasserstoff und Sauerstoff wird beschrieben. Die Gase werden durch Elektrolyse des Mineralmediums erzeugt. Durch Verwendung von zwei Anoden, von denen die eine außerhalb des Kulturgefäßes angeordnet ist, läßt sich das Verhältnis H2/O2 innerhalb weiter Grenzen verändern. Zur Steuerung und Veränderung der Flußrate zwischen 20 und 720 ml/Std dient ein Tropfenzähler mit Platinkontakten, ein Magnetventil und ein Impulsgeber.Wurde Hydrogenomonas H 16 in statischer Kultur mit H2 oder O2-Begrenzung herangezogen, so nahmen die Rate der Gasaufnahme und die Hydrogenase-Aktivität mit zunehmendem Alter der Kultur ab. In kontinuierlicher Kultur mit Wasserstoff als wachstumsbegrenzendem Faktor wurden die Beziehungen zwischen Wachstumsrate, Bakterienkonzentration und Wasserstoffverbrauch untersucht. Bei gleichen Wachstumsraten unter Begrenzung des Wachstums a) durch Wasserstoff und b) durch Sauerstoff wurden einige Stoffwechsel-Aktivitäten miteinander verglichen. Wurde das Wachstum durch Wasserstoff begrenzt, so war der Gehalt an Poly-β-hydroxybuttersäure gering und die Aktivitäten von Hydrogenase und Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase waren hoch. Bei Begrenzung des Wachstums durch Sauerstoff häuften die Zellen Poly-β-hydroxybuttersäure bis zu 23% des Trockengewichts an; die Aktivitäten der Hydrogenase und Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase waren gering. Das H2/CO2-Verhältnis betrug bei Begrenzung durch Wasserstoff 9,1, bei Begrenzung durch Sauerstoff 4,6. Die spezifischen Aktivitäten anderer Enzyme (Phosphoglycerokinase und NADP-spezifische Glutamat-Dehydrogenase) unterschieden sich nicht nennenswert.

Excretion of metabolites by hydrogen bacteria I. Autotrophic and heterotrophic fermentations

SummaryThe excretion of metabolites by 48 wild-type and mutant strains belonging to various species and genera of aerobic hydrogen-oxidizing bacteria was studied. The cells were grown autotrophically and heterotrophically, and samples were analyzed by gas chromatrographic techniques. The following metabolites were identified and quantitatively determined: acetate, ethanol, malate, citrate, lactate, succinate, 2-propanol, 2-methylpropanoate, 3-methylbutanoate, cis-aconitate, acetone, 2-oxoglutarate, isocitrate, butanoate, and methanol. The excretion of the metabolites started when ammonia and oxygen became limiting. The concentrations reached a maximum, whereupon the excreted products were reconsumed.The total concentration of the metabolites identified reached 5 g/l. Maximum concentrations were measured when mutants of Alcaligenes eutrophus lacking the ability to accumulate poly-3-hydroxybutanoate were grown on fructose, gluconate, or lactate in the fermenter under conditions of ammonia limitation and when the carbon source was present in excess.