Han Shan

桑氏链霉菌几丁质酶 ChiKJ40 基因的克隆表达及其抑菌作用

背景目前关于桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii)生防基因的研究不多，仅从其基因组中克隆了2个几丁质酶基因片段，其单个几丁质酶的完整基因序列相关研究未见报道。 目的克隆S. sampsonii KJ40的几丁质酶基因ChiKJ40并进行原核表达，纯化重组蛋白并研究其抑菌作用。 方法采用PCR扩增法从S. sampsonii KJ40中克隆几丁质酶基因ChiKJ40，连接到表达载体pET-32a，导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。使用His标记蛋白质微量纯化试剂盒对重组几丁质酶进行纯化，Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定粗酶液和纯化酶液的浓度，几丁质酶试剂盒测定粗酶液和纯化酶液的几丁质酶活性。观察重组几丁质酶对桉树焦枯病菌(Cylindrocladium scoparium)、栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、链格孢菌(Alternaria alternate)、紫丝核菌(Rhizoctonia violacea)几种致病真菌的抑菌作用。 结果ChiKJ40基因(登录号为MF434484)在E. coli中经IPTG诱导表达，获得42 kD的重组几丁质酶，不同浓度IPTG在37 ℃诱导3 h，蛋白产量无明显变化。0.2 mmol/L IPTG 16 ℃诱导过夜，重组几丁质酶主要以可溶性形式存在于上清，小部分以包涵体存在于沉淀中。粗酶液几丁质酶活性为0.080 U/mL，酶比活力为0.041 U/mg，纯化酶液几丁质酶活性为0.046 U/mL，酶比活力为0.115 U/mg，纯化倍数为2.8，酶活回收率为57.5%。重组几丁质酶处理后，C. scoparium、C. parasitica和A. alternata菌丝细胞出现分节、膨胀，R. violacea菌丝溶解且部分被破坏成碎片。 结论ChiKJ40基因的研究补充了S. sampsonii的生防背景，为几丁质酶基因找到了新的来源，并为其应用奠定了理论基础。