Irene Muñoz

Biodiversity, conservation and current threats to European honeybees

Europe harbours several endemic honeybee (Apis mellifera) subspecies. Yet the distribution of these subspecies is nowadays also much influenced by beekeeping activities. Large scale migratory beekeeping and trade in queens, coupled with the promiscuous mating system of honeybees, have exposed native European honeybees to increasing introgressive hybridization with managed non-native subspecies, which may lead to the loss of valuable combinations of traits shaped by natural selection. Other threats to European honeybees are factors that have caused a progressive decline in A. mellifera throughout the world in recent years, leading to large economic losses and jeopardizing ecosystem functioning. We review the biodiversity of European honeybees and summarize the management and conservation strategies employed by different countries. A comprehensive picture of the beekeeping industry in Europe is also provided. Finally we evaluate the potential threats affecting the biodiversity of European honeybee populations and provide some perspectives for future research.ZusammenfassungDie Unterarten der Honigbienen wurden sowohl mit morphologischen (Box 1) als auch mit molekulargenetischen (Box 2 und 3) Methoden untersucht. Die in Europa vorkommenden elf Unterarten (Abb. 1) werden in vier evolutiven Abstammungslinien eingeteilt. In den entsprechenden Verbreitungsgebieten sind die dazugehörenden Unterarten unterschiedlichen Klima- und Habitatsbedingungen sowie anthropogenen Einflüssen ausgesetzt. Unser erstes Ziel ist es, die Biodiversität der europäischen Honigbienen zu beschreiben und die Strategien zum Schutz der Honigbienen in den einzelnen Ländern zusammenzufassen. Hybridisierungsprozesse wurden vor allem auf der iberischen, italienischen und der Balkan-Halbinsel festgestellt, wohingegen natürliche (aufgrund von Genfluss durch die Mehrfachpaarung der Königin) und durch imkerliche Aktivitäten ausgelöste (durch die Einfuhr von Honigbienen-Unterarten außerhalb ihres natürlichen Verbreitungsgebietes) genetische Introgression in Zentral- und Osteuropa sowie auf Mittelmeerinseln beobachtet wurden. Verschiedene Naturschutzprogramme wurden auf europäischen Inseln (Dänemark, Spanien) und seit kurzem auch in anderen europäischen Ländern (Frankreich, Norwegen, Slowenien und Österreich) etabliert. Für einen sinnvollen Honigbienenschutz muss aber der Status der imkerlich gehaltenen Honigbienenpopulation in den jeweiligen Ländern mit berücksichtigt werden. Daher müssen zunächst detaillierte Informationen zur Imkerei in den einzelnen Ländern gesammelt werden, bevor zukünftige Naturschutzprogramme entwickelt werden (Abb. 2 und Tab. I in „supplementary data“). Auf dieser Grundlage werden zwei Hauptansätze für zukünftige Naturschutzrichtlinien vorgeschlagen: Beschränkung der Einfuhr von „überlegenen“ Unterarten in Gebiete, die bereits von nativen Honigbienenpopulationen besetzt sind sowie die Aufrechterhaltung der genetischen Diversität in natürlichen Honigbienenpopulationen. Immer mehr Faktoren wie veränderte Landnutzung, die Verbreitung von Krankheitserregern und Parasiten, der Einsatz von Pestiziden und Herbiziden (Tab. I) bedrohen die Honigbienen in Europa und gefährden damit auch die Funktion des Ökosystems durch eine unzureichende Bestäubung von Wild- und Kulturpflanzen.Das vor kurzem aufgeschlüsselte Honigbienen-Genom bietet nun aber neue Möglichkeiten, auf molekularer Ebene die Genetik, Physiologie und das Verhalten der Honigbienen zu untersuchen. Molekulare Marker wie SNPs („Single Nucleotide Polymorphisms“) und Mikrosatelliten ermöglichen neue Einblicke in die Populationsstruktur der Honigbienen und die Analyse des Honigbienen-Proteoms wird uns zusätzlich Informationen über die Struktur, Funktion und Wechselwirkungen der von den jeweiligen Genen produzierten Proteine geben.Eine abschließende Überlegung ist, dass der Honigbienenschutz eng mit der Aufrechterhaltung der Imkerei verbunden ist, die als zukunftsträchtiger Bestandteil der landwirtschaftlichen Praxis auch für die junge Generation attraktiv sein sollte. Für eine nachhaltige Unterstützung der Imkerei sollten die Berufsausbildung verbessert, moderne Betriebsweisen eingeführt, angewandte Forschung zur Bienenbiologie, Genetik und Krankheitsbekämpfung durchgeführt sowie sinnvolle Richtlinien zum Schutz wertvoller Ökosysteme umgesetzt werden.

Standard methods for molecular research in Apis mellifera

Summary From studies of behaviour, chemical communication, genomics and developmental biology, among many others, honey bees have long been a key organism for fundamental breakthroughs in biology. With a genome sequence in hand, and much improved genetic tools, honey bees are now an even more appealing target for answering the major questions of evolutionary biology, population structure, and social organization. At the same time, agricultural incentives to understand how honey bees fall prey to disease, or evade and survive their many pests and pathogens, have pushed for a genetic understanding of individual and social immunity in this species. Below we describe and reference tools for using modern molecular-biology techniques to understand bee behaviour, health, and other aspects of their biology. We focus on DNA and RNA techniques, largely because techniques for assessing bee proteins are covered in detail in Hartfelder et al. (2013). We cover practical needs for bee sampling, transport, and storage, and then discuss a range of current techniques for genetic analysis. We then provide a roadmap for genomic resources and methods for studying bees, followed by specific statistical protocols for population genetics, quantitative genetics, and phylogenetics. Finally, we end with three important tools for predicting gene regulation and function in honey bees: Fluorescence in situ hybridization (FISH), RNA interference (RNAi), and the estimation of chromosomal methylation and its role in epigenetic gene regulation.

Population genetic structure of coastal Croatian honeybees (Apis mellifera carnica)

The genetic structure and molecular diversity of Croatian honeybee coastal populations have been investigated with microsatellite and mitochondrial markers. According to sequence data of the mitochondrial tRNAleu-cox2 intergenic region, all analysed samples belong to the Central Mediterranean and Southeast European evolutionary C-lineage. Four mitochondrial haplotypes have been found in the Croatian honeybees, whereas two newly described have been found in Croatia and Greek respectively. Through the Bayesian analysis of microsatellite variation, two groups can be distinguished within the Croatian honeybee population, suggesting the existence of two subpopulations of A. m. carnica. The relation of these subpopulations with previously described ecotypes and regional variations is discussed. These results emphasize the importance of sequencing in the description of new haplotypes and therefore, in the inference of molecular biodiversity within honeybee populations. The description of two subpopulations in coastal Croatian honeybees must be considered in future conservation strategies.ZusammenfassungDas Ziel dieser Untersuchung ist eine Einschätzung der genetischen Variabilität der kroatischen Honigbiene und die Suche nach molekularen Belegen für bereits auf der Basis von morphometrischen und ökologischen Daten beschriebene Ökotypen und regionale Variationen (Ruttner, 1992). Zu Vergleichszwecken wurden Proben aus Italien und Griechenland ebenfalls analysiert.Zur Erforschung der Biogeographie von Apis mellifera wird im wesentlichen die Analyse der Variabilität der mitochondrialen DNA herangezogen, während die Struktur von Populationen aus der Analyse von Mikrosatelliten abgeleitet wird. Die anerkannten 29 Unterarten der Honigbiene (Engel, 1999; Sheppard und Meixner, 2003) wurden in fünf evolutionäre Linien eingruppiert (Garnery et al., 1992; Estoup et al., 1995; Franck et al., 2000b; Whitfield et al., 2006), von denen vier natürlicherweise im Mittelmeerbecken vorkommen: M (West- und Nordeuropa), C (Zentrales Mittelmeer und Südosteuropa), O (Naher Osten) und A (Afrika).Fünfundvierzig Bienenvölker aus Kroatien, Italien und Griechenland wurden untersucht (Tab. I und Abb. 1), die nach Ergebnissen von Sequenzdaten der mitochondrialen tRNAleu-cox2 Region alle zur mitochondrialen C-Linie gehören. Zwei neue mtDNA Haplotypen, C2e und C2i wurden in Kroatien, bzw. in Griechenland, gefunden, während alle italienischen Proben den C1 Haplotypen aufwiesen. In Kroatien wurden vier Haplotypen mit unterschiedlichen Häufigkeiten nachgewiesen: C1 (0.35), C2c (0.15), C2d (0.05), und C2e (0.45). In Griechenland war der Haplotyp C2d (0.80) häufiger als Typ C2i (0.20) (Abb. 1).In der Bayesschen Analyse der Mikrosatelliten auf der Basis von vier Gruppen wurde die kroatische Bienenpopulation in zwei Untergruppen mit einer mehr nördlichen bzw. mehr südlichen Verbreitung aufgeteilt (Kroatien-1 = 51,7 % und Kroatien-2 = 39,9 %), wobei jedoch 6,3 % der kroatischen Bienen der italienischen Population zugeordnet wurden (Tab. III und Abb. 3). Die PCA Analysen zeigten, dass sich bei Berücksichtigung von vier Gruppen die kroatischen Subpopulationen unterschiedlich zuordnen, wobei Subpopulation-2 eher den italienischen Bienen und Subpopulation-1 eher einigen griechischen Proben angenähert war (Abb. 4). Genetische Introgression aus der benachbarten A. m. ligustica in Italien wurde beobachtet, da 14,7 % der kroatischen Subpopulation-2 der italienischen Population zugeordnet wurden (Abb. 3).Der C2c Haplotyp wurde auch in Slowenien gefunden (Sušnik et al., 2004), womit eine enge Verwandtschaft zwischen der kroatischen und slowenischen Population teilweise bestätigt wurde. Dies geht wahrscheinlich auf den beidseitigen Austausch von Bienenmaterial zwischen Imkern zurück. Aus dem Auftreten von zwei Haplotypen, die für andere Unterarten charakteristisch sind, werden Einkreuzungseffekte abgeleitet, die entweder auf natürliche Weise zustande kommen, oder auf menschlichen Einfluss durch Königinnenhandel zurückgehen. Die Anwesenheit von zwei verschiedenen kroatischen Haplotypen in der dalmatischen Region wurde gezeigt: Subpopulation-1 kommt in nördlicheren Gebieten vor, während Subpopulation-2 im südlichen Teil des Gebiets auftritt. Die molekulare Analyse der kroatischen Honigbienen belegt die Notwendigkeit für ähnliche molekulare Untersuchungen von Bienenpopulationen in benachbarten Regionen, wo noch größere Vorkommen der autochthonen Carnica-Biene existieren.

Signatures of selection in the Iberian honey bee (Apis mellifera iberiensis) revealed by a genome scan analysis of single nucleotide polymorphisms.

Understanding the genetic mechanisms of adaptive population divergence is one of the most fundamental endeavours in evolutionary biology and is becoming increasingly important as it will allow predictions about how organisms will respond to global environmental crisis. This is particularly important for the honey bee, a species of unquestionable ecological and economical importance that has been exposed to increasing human‐mediated selection pressures. Here, we conducted a single nucleotide polymorphism (SNP)‐based genome scan in honey bees collected across an environmental gradient in Iberia and used four FST‐based outlier tests to identify genomic regions exhibiting signatures of selection. Additionally, we analysed associations between genetic and environmental data for the identification of factors that might be correlated or act as selective pressures. With these approaches, 4.4% (17 of 383) of outlier loci were cross‐validated by four FST‐based methods, and 8.9% (34 of 383) were cross‐validated by at least three methods. Of the 34 outliers, 15 were found to be strongly associated with one or more environmental variables. Further support for selection, provided by functional genomic information, was particularly compelling for SNP outliers mapped to different genes putatively involved in the same function such as vision, xenobiotic detoxification and innate immune response. This study enabled a more rigorous consideration of selection as the underlying cause of diversity patterns in Iberian honey bees, representing an important first step towards the identification of polymorphisms implicated in local adaptation and possibly in response to recent human‐mediated environmental changes.

Conserving genetic diversity in the honeybee: comments on Harpur et al. (2012).

The article by Harpur et al. (2012) ‘Management increases genetic diversity of honey bees via admixture’ concludes that ‘…honey bees do not suffer from reduced genetic diversity caused by management and, consequently, that reduced genetic diversity is probably not contributing to declines of managed Apis mellifera populations’. In the light of current honeybee and beekeeping declines and their consequences for honeybee conservation and the pollination services they provide, we would like to express our concern about the conclusions drawn from the results of Harpur et al. (2012). While many honeybee management practices do not imply admixture, we are convinced that the large‐scale genetic homogenization of admixed populations could drive the loss of valuable local adaptations. We also point out that the authors did not account for the extensive gene flow that occurs between managed and wild/feral honeybee populations and raise concerns about the data set used. Finally, we caution against underestimating the importance of genetic diversity for honeybee colonies and highlight the importance of promoting the use of endemic honeybee subspecies in apiculture.

Reduced SNP Panels for Genetic Identification and Introgression Analysis in the Dark Honey Bee (Apis mellifera mellifera)

Beekeeping activities, especially queen trading, have shaped the distribution of honey bee (Apis mellifera) subspecies in Europe, and have resulted in extensive introductions of two eastern European C-lineage subspecies (A. m. ligustica and A. m. carnica) into the native range of the M-lineage A. m. mellifera subspecies in Western Europe. As a consequence, replacement and gene flow between native and commercial populations have occurred at varying levels across western European populations. Genetic identification and introgression analysis using molecular markers is an important tool for management and conservation of honey bee subspecies. Previous studies have monitored introgression by using microsatellite, PCR-RFLP markers and most recently, high density assays using single nucleotide polymorphism (SNP) markers. While the latter are almost prohibitively expensive, the information gained to date can be exploited to create a reduced panel containing the most ancestry-informative markers (AIMs) for those purposes with very little loss of information. The objective of this study was to design reduced panels of AIMs to verify the origin of A. m. mellifera individuals and to provide accurate estimates of the level of C-lineage introgression into their genome. The discriminant power of the SNPs using a variety of metrics and approaches including the Weir & Cockerham’s FST, an FST-based outlier test, Delta, informativeness (In), and PCA was evaluated. This study shows that reduced AIMs panels assign individuals to the correct origin and calculates the admixture level with a high degree of accuracy. These panels provide an essential tool in Europe for genetic stock identification and estimation of admixture levels which can assist management strategies and monitor honey bee conservation programs.

Population structure of North African honey bees is influenced by both biological and anthropogenic factors

Honey bee diversity is under threat due to anthropogenic factors as the use of pesticides and the replacement of local colonies to recover from colony losses. To assess the effect of these activities on the genetic diversity and structure of North African honey bee colonies, we studied colonies from the north (Tellian) and the south (Saharan) regions in Algeria, by determining their mitochondrial haplotype and the variation of ten microsatellite loci. Particular haplotypes have been found with a high frequency in each region that may constitute subspecies-specific markers for Apis mellifera intermissa (haplotype A8 at the north) and A. m. sahariensis (haplotype A9 at the south). Moreover, the presence of the haplotype A8 in some Saharan colonies may reflect recent introductions of A. m. intermissa. Structure analysis suggests that a natural differentiation between honey bee populations from Saharan and Tellian regions still exists despite increased colony movements (migration, queen purchases, etc.) during the last decades. One apiary established for the conservation of A. m. sahariensis showed no indication of maternal introgression since all the colonies bear the same haplotype A9. Furthermore, Hardy–Weinberg equilibrium observed in this population indicates that this apiary is appropriate for conservation programs of A. m. sahariensis.

Climate rather than geography separates two European honeybee subspecies

Both climatic and geographical factors play an important role for the biogeographical distribution of species. The Carpathian mountain ridge has been suggested as a natural geographical divide between the two honeybee subspecies Apis mellifera carnica and A. m. macedonica. We sampled one worker from one colony each at 138 traditional apiaries located across the Carpathians spanning from the Hungarian plains to the Danube delta. All samples were sequenced at the mitochondrial tRNALeu‐cox2 intergenic region and genotyped at twelve microsatellite loci. The Carpathians had only limited impact on the biogeography because both subspecies were abundant on either side of the mountain ridge. In contrast, subspecies differentiation strongly correlated with the various temperature zones in Romania. A. m. carnica is more abundant in regions with the mean average temperature below 9 °C, whereas A. m. macedonica honeybees are more frequent in regions with mean temperatures above 9 °C. This range selection may have impact on the future biogeography in the light of anticipated global climatic changes.

Temporal Analysis of the Genetic Diversity in a Honey Bee Mating Area of an Island Population (La Palma, Canary Islands, Spain)

Temporal Analysis of the Genetic Diversity in a Honey Bee Mating Area of an Island Population (La Palma, Canary Islands, Spain) A law to conserve the honey bee population on La Palma (Canary Islands) was stated in 2001. The introduction of foreign subspecies was prohibited. A natural mating area for local queens was established at the northeast section of the island. To evaluate the genetic diversity of the honey bee colonies located in this area, analyses of the mitochondrial (tRNAleu-cox2 intergenic region) and nuclear (five microsatellite loci) variation were performed by comparing two surveys conducted in 1998 and 2006 (i.e., before and after the conservation program started in 2001). While mitochondrial variability changed significantly in this area over the period analyzed, such differences were not observed at the nuclear level. These data may have implications relating to the control of selected colonies included in the conservation program. This is particularly true regarding the introduction of the colonies to other islands of the archipelago. Okresowa Analiza Różnorodności Genetycznej Populacji Pszczół z Izolowanego Trutowiska na Wyspie (La Palma, Wyspy Kanaryjskie, Hiszpania) W 2001 roku przyjęto ustawę o ochronie populacji pszczół na wyspie La Palma (Wyspy Kanaryjskie), a wprowadzanie obcych pododmian zostało zakazane. W północnowschodniej części wyspy utworzono naturalne trutowisko dla miejscowych matek pszczelich. Aby ocenić różnorodność genetyczną rodzin pszczelich na tym terenie, przeprowadzono analizę zmienności mitochondrialnej (region międzygenowytRNAleu-cox2) oraz jądrowej (pięć loci mikrosatelitanych) w oparciu o porównanie wyników badań przeprowadzonych w roku 1998 oraz 2006 (tj. przed i po wprowadzeniu programu ochrony w 2001 roku). W analizowanym okresie stwierdzono dużą różnicę w zmienności mitochondrialnej na obszarze objętym badaniami, podczas gdy na poziomie jądrowym takich różnic nie zaobserwowano. Uzyskane wyniki mogą być przydatne w kontrolowaniu wybranych rodzin pszczelich objętych programem ochrony. Jest to szczególnie istotne w przypadku wprowadzania rodzin pszczelich na inne wyspy archipelagu.

Genetic variation of Apis mellifera from Serbia inferred from mitochondrial analysis

Genetic variation of Apis mellifera from Serbia inferred from mitochondrial analysis Two honeybee subspecies inhabit Serbia; Apis mellifera carnica and A. m. macedonica. Both belong to eastern Mediterranean (C) evolutionary lineage. Furthermore three Serbian honeybee ecotypes restricted to particular regions, were defined through morphometry and cytogenetic analyses. In this study, mitochondrial data have been used to analyze the molecular diversity of the honeybee population from Serbia. Seven haplotypes of the C evolutionary lineage have been found, two of them are newly described (C2o and C2p) and restricted to two regions, which ultimately increased the number of haplotypes found in this lineage. Comparisons with surrounding honeybee populations suggest a hybrid situation between A. m. carnica and A. m. macedonica and also introgression from A. m. ligustica. The results should be considered when dealing with future conservation strategies, and for pathogen-parasite-tolerant breeding programs. Różnorodność Genetyczn a Apis Mellifera w Serbii na Podstawie Badań Mitochondrialnych Na terenie Serbii występują dwa podgatunki pszczoły miodenj: Apis mellifera carnica i A. m. macedonica. Oba te podgatunki należą do wschodnio-śródziemnomorskiej linii ewolucyjnej (C). Na podstawie analiz morfometrycznych oraz cytogenetycznych zidentyfikowano trzy ekotypy pszczoły miodnej występujące w określonych rejonach Serbii. W przedstawionych badaniach, do określenia różnorodności molekularnej serbskiej populacji pszczół wykorzystano wyniki analiz mitochondrialnych. Stwierdzono siedem haplotypów linii ewolucyjnej C, z których dwa to nieznane wcześniej haplotypy C2o i C2p o występowaniu ograniczonym do dwóch regionów, co w efekcie zwiększa liczbę haplotypów tej linii. Porównania z okolicznymi populacjami pszczół sugerują mieszanie się pszczół A. m. carnica i A. m. macedonica oraz introgresję A. m. ligustica. Uzyskane wyniki należy uwzględniać podczas ustalania programów hodowli zachowawczych oraz w programach hodowlanych zorientowanych na selekcję pszczół o zwiększonej tolerancji na patogeny i pasożyty.