J. Gilet

Involvement of CCL18 in Allergic Asthma

Allergic asthma is associated with a pulmonary recruitment of Th type 2 cells, basophils, and eosinophils, mainly linked to chemokine production. CCL18 is a chemokine preferentially expressed in the lung, secreted by APCs, induced by Th2-type cytokines, and only present in humans. Therefore, CCL18 may be involved in allergic asthma. PBMC from asthmatics allergic to house dust mite cultured in the presence of Dermatophagoides pteronyssinus 1 (Der p 1) allergen secreted CCL18, 48 and 72 h after stimulation, whereas those from healthy donors did not. Part of CCL18 was directly derived from Der p 1-stimulated plasmacytoid dendritic cells, whereas the other part was linked to monocyte activation by IL-4 and IL-13 produced by Der p 1-stimulated T cells. In bronchoalveolar lavages from untreated asthmatic allergic patients, CCL18 was highly increased compared with controls. Functionally, CCL18 preferentially attracted in vitro-polarized Th2 cells and basophils, but not eosinophils and Th1 cells, and induced basophil histamine and intracellular calcium release. These data show a new function for CCL18, i.e., the recruitment of Th2 cells and basophils, and suggest that CCL18 may play a predominant role in allergic asthma.

Role of CCL17 in the Generation of Cutaneous Inflammatory Reactions in Hu-PBMC-SCID Mice Grafted with Human Skin

CCL17 may be of interest in skin inflammation, because it mainly attracts T cells expressing the cutaneous homing receptor and binds the chemokine receptor CCR4, preferentially expressed on Th-2 cells. We evaluated the in vivo effect of CCL17 injection in a humanized mouse model. (125)I-CCL17 injection into human skin grafted on severe combined immunodeficient (SCID) mice reconstituted with peripheral blood mononuclear cells resulted in a rapid transportation of CCL17 from the skin to the homolateral lymph nodes, followed 3 hours later by a lymph node infiltration of human memory CD4+ cells and dendritic cells. Intradermal injection of CCL17 resulted 24 hours later in a cutaneous recruitment of human memory CD4+ cells, monocytes, and basophils, but also murine eosinophils. In SCID mice reconstituted with polarized Th-1 or Th-2 cells, intradermal injection of CCL17 resulted in the recruitment of IL-4+ Th-2 cells but not of IFN-gamma+ Th-1 cells, whereas CCL17 was able to recruit both subsets in vitro. These results suggest that, in a humanized in vivo model, CCL17 is sufficient per se to induce a lymph node recruitment of memory CD4+ and dendritic cells and a cutaneous recruitment of Th-2-type cells, stressing it as an important actor in the initiation and development of Th-2-associated skin inflammation.

066 Implication de CCL18 dans le développement de l’asthme allergique

Introduction L’asthme allergique est caracterise par le recrutement au niveau pulmonaire de lymphocytes de type Th2, d’eosino-philes et de basophiles, grâce a un reseau complexe de chimiokines. CCL18 est une chimiokine exprimee majoritairement au niveau pulmonaire, par les cellules presentatrices d’antigene activees par des cytokines de type Th2, ce qui suggere une possible implication dans le developpement de l’asthme allergique. Methodes Des cellules mononucleees du sang peripherique de patient sains (S) ou asthmatiques et allergiques aux acariens ont ete mises en culture en presence de l’allergene majeur de Dermatopha-goides pteronyssinus (Derp 1). La production de transcrits CCL18 par ces cellules, ainsi que sa secretion a ete evalue apres contact avec l’allergene, en presence d’anticorps neutralisants anti-IL-4, anti-IL-13 ou anti-ILlO, mais egalement apres depletion des lymphocytes T ou des monocytes. La production de CCL18 par les cellules dendritiques de la lignee myeloide ou plasmacytoide en presence de Derp 1 a egalement ete testee. Le pouvoir chimiotaxique de CCL18 a enfin ete evalue vis-a-vis des lymphocytes de type Th2, et des basophiles. Resultats Les cellules de patients asthmatiques allergiques produisent du CCL18 48 a 72 heures apres contact avec l’allergene, mais pas les cellules de patients sains. Cette production est abolie en presence d’anticorps anti-IL-4 et anti-IL-13, ou apres depletion des lymphocytes T ou des monocytes. Une partie de la production de CCL18 semble directement issue des cellules dendritiques plasmacytoides, alors que l’autre partie semble provenir des monocytes actives par l’IL-4 et l’IL-13 produits par les lymphocytes. Enfin, de grandes quantites de CCL18 ont ete trouvees dans le lavage broncho-alveolaire de patients asthmatiques allergiques non traites. Fonctionnellement, CCL18 recrute les lymphocytes Th2 et les basophiles, mais pas les lymphocytes Thl ni les eosinophiles. CCL18 est egalement capable d’induire une liberation d’histamine par les basophiles. Conclusion Ces donnees mettent en evidence de nouvelles fonctions de CCL18, suggerant une implication forte de cette chimiokine dans le developpement de la reaction d’asthme allergique.

072 Développement d’une méthode de purification de la CC chimiokine PARC/CCL18 et ses dérivés par passage sur gel de silice

Introduction Dans la reponse allergique, le processus inflammatoire joue un role deletere. Parmi les mediateurs de l’inflammation les chimiokines, dont le PARC/CCL18 fait partie, semblent impliquees dans de nombreuses pathologies. Il a ete montre que le PARC etait secrete non seulement des l’intrusion de l’allergene par les cellules dendritiques, mais aussi beaucoup plus tardivement (≈ 36-48H), ce qui pourrait l’inclure dans le processus perennisant la reponse allergique. Materiels et methodes Le PARC ainsi que ses derives sont produits par un systeme eucaryote (CHO DG44). Les cellules sont cultivees sans serum de veau foetal. L’ensemble des proteines est dose a l’aide du kit Protein assay de BioRad et dune lecture de l’absorbance. Le dosage du PARC est obtenu par un dosage ELISA sandwich. Pour une resolution plus importante, les solutions sont dosees par migration electrophoretique et revelation au nitrate d’argent. La silice utilisee pour les experiences nous a ete fournie par Millipore (Granular Silice, Si-500A, 90-130 um, Matrex®). Resultats L’incubation de surnageant de culture pure sur la silice ne permet pas la fixation des proteines sur la silice. Il a donc ete necessaire de definir les conditions permettant une adsorption quantitative. Nous avons reussi a adsorber 95 % du PARC et 80 % des proteines en tamponnant le surnageant en 0,5 M NaCl, Tris 20 mM, pH 8. En ce qui concerne l’elution des proteines, un gradient de concentration de 0,1 a 5 M NaCl n’a pas permis la desorption. Apres avoir teste de nombreux eluants, nous avons decouvert qu’une solution de PolyEthylene Glycol (PEG) a 20 % permettait d’eluer selectivement une majorite des proteines totales hormis le PARC. En outre, une solution KHCO3 1 M, NaCl 0,5 M, Tris 20 mM pH 8 permet de creer un differentiel d’elution entre les proteines totales et le PARC (20 % contre 80 %). Ces resultats nous ont suggere l’etablissement d’une sequence d’elution PEG-KHCO3. L’analyse avec le nitrate d’argent du second eluat nous donne un taux d’enrichissement proteique en PARC de l’ordre de 1 000. Conclusions Cette technique nous permet de concentrer considerablement le PARC, permettant par la suite d’optimiser une purification par adsorption desorption sur Heparine-Sepharose, et finalement obtenir des concentrations en PARC suffisamment elevees pour les manipulations en laboratoire.