M. Krempf

Multiplexed peptide analysis for kinetic measurements of major human apolipoproteins by LC/MS/MS.

A multiplexed assay was developed by MS to analyze, in a single run, six major human Apos involved in lipoprotein metabolism: ApoA-I, ApoA-II, ApoB100, ApoC-II, ApoC-III, and ApoE. This method was validated in vivo in six subjects who received a 14 h constant infusion of [5,5,5-2H3]L-leucine at 10 μM/kg/h. Plasma lipoprotein fractions were isolated from collected blood samples and were digested with trypsin. Proteotypic peptides were subsequently analyzed by LC/MS/MS. Enrichment measurement data were compared with those obtained by the standard method using GC/MS. The required time to obtain the LC/MS/MS data was less than that needed for GC/MS. The enrichments from both methods were correlated for ApoA-I (r = 0.994; P < 0.0001) and ApoB100 (r = 0.999; P < 0.0001), and the Bland-Altman plot confirmed the similarity of the two methods. Intra- and inter-assay variability calculated for the six Apos of interest did not exceed 10.7 and 12.5%, respectively, and kinetic parameters were similar and/or in agreement with previously reported data. Therefore, LC/MS/MS can be considered as a useful tool for human Apo kinetic studies using stable isotopes.

Plasma PCSK9 measurement by liquid chromatography-Tandem mass spectrometry and comparison with conventional ELISA

The combination of liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and trypsin proteolysis is an effective tool for accurate quantitation of multiple proteins in a single run. However, expensive samples pre-treatment as immunoenrichment are often required to analyze low abundant proteins. Plasma proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9), a circulating regulator of low-density lipoprotein metabolism, was studied as an example of a low abundant plasma protein. We investigated post-proteolysis solid-phase extraction (SPE) as an alternative strategy to improve its detection. After optimization of pretreatment, including denaturation, reduction, alkylation, tryptic digestion and selective SPE concentration, 91±7% of PCSK9 was recovered from human plasma samples and coefficients of variation were less than 13.2% with a lower limit of quantification of 37.5ng/ml. This LC-MS/MS method was compared with standard enzyme-linked immunosorbent assay in 30 human plasma samples with a broad range of PCSK9 concentrations. Both methods were significantly correlated (r=0.936, p<0.001) with less than 7% of the values out of the 95% confidence interval and similar concentrations were measured using either LC-MS/MS or ELISA methods (514.2±217.2 vs. 504.2±231.0ng/ml, respectively- p=NS). This method involving SPE is an effective measurement tool for low abundant plasma protein analysis that could be easily included in multiplexed assays.

Severe decrease in high-density lipoprotein cholesterol with the combination of fibrates and ezetimibe: A case series

A sudden and severe drug-induced decrease in plasma high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) is a rare condition. We report 2 patients with familial hypercholesterolemia treated with statins and fibrates and 2 others with mixed dyslipidemia treated with fibrates, who presented with a sudden and severe decrease in HDL-C (from -44% to -95%, compared with baseline). Three of the patients were treated with fibrates and had a sudden decrease in HDL-C after the adjunction of ezetimibe. HDL-C returned to normal levels after discontinuation of the offending therapies. In 2 of these patients, the reintroduction of ezetimibe with no fibrates did not affect HDL-C. In conclusion, we report a new profile of patients who are at risk for a sudden drop of HDL-C related to treatment with a combination of fibrates and ezetimibe. Although a sudden drop of HDL-C is a rare event, we recommend to carefully monitor plasma HDL-C in patients submitted to both drugs.

P014 Caractéristiques des patients avec une artériopathie des membres inférieurs dans le registre SURCOUF

Introduction Le registre Surcouf recueille les donnees de patients diabetiques dans l’Ouest de la France dans des centres hospitaliers et aupres de medecins generalistes et diabetologues liberaux. L’objectif de cette etude etait de preciser le profil clinique et le traitement des patients avec une arteriopathie des membres inferieurs (AOMI). Patients et methodes Le registre est alimente a partir d’une fiche accessible en ligne. Les medecins sont sollicites et aides pour cela par un delegue de recherche clinique. Actuellement, 8 500 patients diabetiques sont entres dans cette base depuis 2011. Resultats Parmi les 8 500 patients, 651 ont ete declares avec une AOMI (7,6 %). Parmi eux, 88 % etaient DT2 soit 8 % des DT2 et 4 % des DT1. Parmi eux, 10 % avaient une plaie de pied, 2 % etaient amputes, 8 % et 6 % avaient eu une angioplastie ou un pontage. Une cardiopathie ischemique etait signalee pour 47 % et 29 % avaient eu une revascularisation. Un AVC et/ou un atherome carotidien n’etaient rapporte que pour 10 %. Environ 25 % avaient une retinopathie dont la moitie tres severe, 40 % avaient une neuropathie et 24 % une clearance de la creatinine Conclusion La frequence de l’AOMI est moins de 10 % et elle s’accompagne frequemment d’une cardiopathie ischemique et d’une neuropathie peripherique. La frequence des autres complications n’est pas tres elevee par rapport aux autres patients et les traitements ne permettent pas en general d’atteindre les objectifs recommandes. Declaration d’interet Les auteurs declarent ne pas avoir d’interet direct ou indirect (financier ou en nature) avec un organisme prive, industriel ou commercial en relation avec le sujet presente.

P040 Existe-t-il des biomarqueurs lipidiques prédictifs du diabète de type 2 ? Application sur deux cohortes d’origine différente

Introduction Des modifications du lipidome chez les diabetiques de type 2 (DT2) ont ete rapportees deja presentes chez les pre-diabetiques (MEIKLE, 2013 PloS One, 8 : 74341). Ces biomarqueurs lipidiques predictifs permettraient d’identifier les patients a risque d’evoluer vers le DT2 et proposer des interventions therapeutiques ciblees. Le but de cette etude etait de confirmer ces biomarqueurs predictifs de DT2 chez des patients issus de deux cohortes independantes ? Patients et methodes Pour la cohorte iranienne ICS, 20 sujets non diabetiques en 2001 et en 2007 ont ete selectionnes et compares a 20 sujets non diabetiques en 2001devenus diabetiques en 2007. Pour l’etude francaise IT-DIAB, 72 sujets prediabetiques ont ete selectionnes et analyses en deux groupes comparables dont 36 sont restes prediabetiques et 36 sont devenus diabetiques en 2 annees. L’analyse lipidomique globale plasmatique a ete realisee par UHPLC-ESI-HRMS. Resultats Les analyses multivariees n’ont pas mis en evidence la separation des differents groupes pour les etudes ICS et IT-DIAB. Concernant ICS, aucun biomarqueur lipidique specifique et predictif du diabete de type 2 n’a ete mis en evidence. Pour IT-DIAB, 20 lipides differents entre les deux groupes ont ete identifies mais sans lien direct avec les donnees anterieures. Conclusion Ces donnees ne permettent pas de confirmer les resultats prealablement publies sur le lipidome pour la prediction du diabete de type 2. Differentes approches methodologiques, statistiques ou specifiques aux groupes de patients etudies pourraient cependant expliquer ce resultat. Cette approche de detection de biomarqueurs predictifs est prometteuse mais complexe et meriterait d’etre standardisee. Declaration d’interet Les auteurs declarent ne pas avoir d’interet direct ou indirect (financier ou en nature) avec un organisme prive, industriel ou commercial en relation avec le sujet presente.