M. Montag

Xenotransplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with ovarian tumors into SCID mice—no evidence of malignant cell contamination

This study examined the possible presence of malignant cells in ovarian cortex from patients with ovarian tumors after xenografting of the ovarian tissue into severe combined immunodeficiency mice. None of the mice presented symptoms of reintroduced malignancy nor did microscopic and immunohistochemical evaluation of the grafts raise any suspicion of residual malignant disease.

Activation of mouse oocytes requires multiple sperm factors but not sperm PLCγ1

A sperm cytosolic factor is responsible for oocyte activation at fertilization in mammals. The molecular identity of this factor is not yet known, although a sperm phospholipase Cgamma (PLCgamma) is a potential candidate. In this study, cation-exchange chromatography with a Heparin column was used for the fractionation of porcine sperm cytosolic extracts. Oocyte activation potential of the resulting fractions was tested and active fractions were subjected to Western blot analysis using antibodies specific to PLCgamma1. PLCgamma1 was detected in fractions other than those supporting oocyte activation (Ca(2+)-release and pronuclear formation). The active Heparin fraction was then purified on a Mono Q anion-exchange column. One of the resulting fractions still contained Ca(2+)-releasing activity, but pronuclear formation did not occur. We conclude that sperm PLCgamma1 is not involved in oocyte activation and that Ca(2+)-release and pronuclear formation requires multiple factors from sperm cytosol.

Recovery of ejaculated spermatozoa for intracytoplasmic sperm injection after anti-inflammatory treatment of an azoospermic patient with genital tract infection : a case report

In this paper our experiences with anti‐inflammatory treatment of an infertile patient with azoospermia and concomitant silent genital infection are reported. The patient was referred to our fertility centre with prediagnosed non‐obstructive azoospermia and no spermatozoa were found in the ejaculate on two occasions. The patient showed leukocytospermia and was suspected to be affected by genital infection. Therefore, anti‐inflammatory treatment was initiated and 8 weeks later examination of the ejaculate revealed a decreased number of leukocytes and the presence of few but motile spermatozoa. Subsequently, two ICSI cycles were performed with anti‐inflammatory therapy in parallel and a sufficient number of spermatozoa could be retrieved for injection. However, in a third cycle without previous treatment, examination of the ejaculate again revealed azoospermia and leukocytospermia.

Temperature-induced sperm nuclear vacuolisation is dependent on sperm preparation.

The influence of temperature during incubation on the degree of sperm nuclear vacuolisation was assessed by two different experiments. In a first experiment, motile spermatozoa from 24 patients were prepared by the swim‐up technique and incubated either at room temperature or at 37u2003°C for up to 4u2003h. The presence of sperm nuclear vacuoles was determined by contrast‐enhanced high magnification microscopy. No statistically significant difference was found in the degree of sperm nuclear vacuoles in both groups (RT: 45.6u2003±u200317.6%; 37u2003°C: 48.4u2003±u200317.0%) following 4u2003h of incubation. In a second experiment, spermatozoa from six patients were either prepared by swim‐up or washed and incubated at 37u2003°C. After 4u2003h of incubation, a significant increase in sperm nuclear vacuolisation was found in washed sperm (from 51.5u2003±u200315.4% to 68.6u2003±u20039.0%; Pu2003<u20030.05) but not in swim‐up sperm (from 51.5u2003±u200315.4% to 48.2u2003±u200317.1%; n.s.). Our data show that the mode of sperm preparation does influence sperm nuclear vacuolisation at 37u2003°C (Experiment II). However, sperm nuclear vacuolisation is unaffected by temperature in motile sperm after preparation and isolation by swim‐up.

Stellenwert der Vitrifikation in der Reproduktionsmedizin

ZusammenfassungDie Vitrifikation ist ein noch recht junges Verfahren zur Kryokonservierung von Zellen und Geweben. Bei der Vitrifikation werden die Zellen aus einem flüssigen Zustand direkt in einen amorphen, vitrifizierten Zustand überführt, und die Bildung von Eiskristallen wird unterbunden. Insbesondere im reproduktionsmedizinischen Bereich zeigen sich vermehrt Einsatzmöglichkeiten für die Vitrifikation. Im Vergleich zu der bereits etablierten Methode der langsamen Kryokonservierung, scheint die Vitrifikation für die als kryobiologisch problematisch einzufrierenden Zellen, Gewebe und Entwicklungsstadien von Vorteil zu sein. Unbefruchtete Eizellen im Metaphase-II-Stadium sowie Blastozysten zeigen nach Vitrifikation sehr gute Überlebens- und Entwicklungsraten. Neue Entwicklungen erlauben die Vitrifikation unter aseptischen Bedingungen und unter Vermeidung des direkten Kontakts zwischen der Probe und flüssigem Stickstoff. Wie bei jeder neuen Technik, müssen bei der Durchführung der Vitrifikation einige wichtige Details beachtet werden, um das volle Potenzial dieser relativ einfachen Technik auszuschöpfen.AbstractVitrification is a relatively new technique for the cryopreservation of cells and tissues. A key element of vitrification is the direct transformation of cells from a fluid state into an amorphous, vitrified state without the formation of ice crystals. Vitrification may be especially useful in the field of reproductive medicine. Compared to the more established method of slow freezing, vitrification seems to be more suitable for cryobiologically difficult to freeze cells, tissues and developmental stages. Unfertilized metaphase II oocytes and blastocysts show very high survival and developmental rates after vitrification. Recent improvements allow for aseptic vitrification by avoiding direct contact between the specimen and liquid nitrogen. As with every new laboratory technique, the introduction of vitrification into the the laboratory requires the careful application of all technical details in order to achieve its full potential.

Polkörperdiagnostik zur Aneuploidie-Testung

Auf dem Gebiet der Reproduktionsmedizin wird die Polkorperbiopsie mit anschliesender Untersuchung des chromosomalen Status der Polkorper innerhalb der letzten Jahre in Deutschland zunehmend eingesetzt. Auf Basis internationaler Veroffentlichungen und auf Grund der langjahrigen Erfahrung der Autoren mit der Etablierung und Durchfuhrung der Polkorperdiagnostik (PKD) in Deutschland soll im Folgenden die Wertigkeit dieses Verfahrens dargestellt werden.

Polkörperdiagnostik bei zytogenetischer Prädisposition

ZusammenfassungDie Polkörperdiagnostik (PKD) ermöglicht die zyto- und molekulargenetische Untersuchung von Eizellen. Das Haupteinsatzgebiet der PKD ist der Nachweis von Chromosomenfehlverteilungen in Eizellen. In der vorliegenden Arbeit stellen wir unsere Untersuchungen nach Einsatz der Polkörperdiagnostik bei bekannter zytogenetischer Prädisposition der Frau vor. Unsere Daten belegen, dass bei mütterlichen Translokationen die Durchführung der Polkörperdiagnostik durchaus sinnvoll ist, da ein Großteil der Eizellen eine Fehlverteilung der an der jeweiligen Translokation beteiligten Chromosomen aufweist. Der frühzeitige Ausschluss von Eizellen mit einer vererbten unbalancierten Translokation resultiert in akzeptablen Schwangerschafts- und Geburtenraten. Interessant sind unsere Befunde bei Frauen mit niedriggradigen Gonosomenmosaiken in peripheren Lymphozyten. Gonosomale Aneuploidien sind auch bei diesen Patientinnen an der Gesamtzahl der Chromosomenfehlverteilungen in reifen Eizellen nicht übermäßig häufig beteiligt.AbstractPolar body diagnosis (PBD) enables the indirect cyto- and molecular genetic analysis of oocytes. Its main application is the detection of chromosomal aneuploidies in oocytes. In this article, we present our investigations on the use of PBD in cases with a known cytogenetic predisposition. Our data show that the application of PBD is beneficial for maternal translocations as the majority of oocytes are unbalanced for the chromosomes involved in the translocation. The exclusion of aneuploid oocytes results in acceptable pregnancy and delivery rates. Our data on women with low level sex chromosome mosaicism in peripheral lymphocytes are equally interesting. Gonosomal aneuploidies were not found to contribute predominantly to the chromosomal disorders identified in mature oocytes in these patients.

Generierung und Konservierung von Keimzellen

ZusammenfassungDie In-vitro-Maturation (IVM) ist eine Technik, welche die Reifung von Eizellen im Germinalvesikelstadium bis hin zur befruchtungsfähigen Metaphase-II-Eizelle beinhaltet. Die Eizellen werden in der Regel gezielt aus kleinen antralen Follikeln gewonnen. Der Erfolg nach 24- bis 36-stündiger Maturation wird derzeit mit der Bildung des 1. Polkörpers als Anzeichen für eine abgeschlossene erste meiotische Reifeteilung belegt. Die Qualität einer in vitro gereiften Eizelle kann durch ein neuartiges polarisationsmikroskopisches Verfahren noch besser eingeschätzt werden. Dieses Verfahren ermöglicht eine deutlich bessere Beurteilung und ist somit ein einzigartiges Instrument, um bestehende IVM-Protokolle zu optimieren. Zusammen mit der inzwischen realistischen Option der erfolgreichen Kryokonservierung von unreifen und reifen Eizellen durch die Vitrifikation eröffnen sich künftig für die IVM neue Einsatzgebiete.AbstractIn vitro maturation (IVM) is a technique which allows the maturation of oocytes from the germinal vesicle stage up to the stage of the fertilization-competent metaphase-II oocytes. Immature oocytes are primarily retrieved from small antral follicles. Their successful maturation is usually documented by formation of the first polar body as an indicator of completion of the first meiotic division. The quality of in vitro matured oocytes can now be judged by polarisation microscopy. This technique allows better quality assessment and is hence a unique instrument for optimising existing IVM protocols. In combination with the now realistic option of successful cryopreservation of mature and immature oocytes by the technique of vitrification, IVM will soon enter new fields of application.

Gibt es Indikationen für “assisted hatching”

ZusammenfassungDie Technik des “assisted hatching” wurde erstmals 1990 beschrieben. Durch die Erzeugung einer künstlichen Öffnung in der Zona pellucida des heranwachsenden Embryos sollte gewährleistet werden, dass der Embryo im Blastozystenstadium zuverlässig aus der Zona pellucida ausschlüpft. Dies ist eine wesentliche Vorbedingung für eine erfolgreiche Implantation und den Eintritt einer Schwangerschaft. Seit Einführung des “assisted hatching” werden die Bedeutung und Einsatzmöglichkeiten dieser Technik kontrovers diskutiert.Durch den Einsatz neuer Techniken und unter Berücksichtigung des Verlaufs des Hatchings in vitro und in vivo ergeben sich neue Indikationsstellungen zum “assisted hatching”. Die aus den Anfangszeiten des “assisted hatching” bekannten Indikationen maternales Alter (>38 Jahre), auffallend dicke Zona pellucida und wiederholtes Implantationsversagen bei guten Embryonen sind auch heute noch gültig, umstritten ist hingegen ob nach Kryokonservierung “assisted hatching” die Schwangerschaftsrate verbessert.Unter In-vivo-Bedingungen sind embryonale und uterine Faktoren am Hatching-Prozess beteiligt. Die genauen physiologischen Abläufe und deren mögliche Störungen sind jedoch noch nicht geklärt.AbstractAssisted hatching was first described in 1990. The introduction of an artifical opening in the zona pellucida of the developing embryo should guarantee successful hatching of the embryo at the blastocyst stage. Embryo hatching is essential for subsequent implantation and for establishing a pregnancy. The introduction of assisted hatching has initiated a controversial discussion about the significance of this technique.The development of new techniques, such as laser assisted hatching, and the increasing knowledge of the hatching process in vitro and in vivo has re-opened this discussion. The former indications for assisted hatching, including maternal age (>38 years), a thick zona pellucida, and repeated failure of implantation despite the transfer of good embryos are still valid. Whether assisted hatching can raise the pregnancy rate following cryopreservation is questionable. Hatching in vivo is accomplished by embryonic and uterine factors. The detailed physiology of this process and possible disturbances have not yet been elucidated.

Screening und mögliche Alternativen zur Detektion von Aneuploidien

ZusammenfassungDer Nachweis von Chromosomenfehlverteilungen, Aneuploidien, erfolgt in der Regel an der Eizelle (1./2. Polkörper) oder am Embryo (Blastomere, Trophektodermzelle der Blastozyste). Für die Diagnostik stehen verschiedene Methoden zur Verfügung; die derzeit international favorisierte ist die Biopsie von Trophektodermzellen in Verbindung mit einer Array-CGH (“comparative genomic hybridization“), wobei letztere künftig durch das NGS („next generation sequencing“) komplementiert wird. Die genannten Verfahren sind invasiv und erlauben eine weitgehend zuverlässige Aussage bezüglich des Vorliegens einer Aneuploidie. Zur Vermeidung einer invasiven Entnahme von embryonalen Zellen werden alternative Methoden diskutiert, mit denen sich Aneuploidien indirekt bzw. auf der Basis von Korrelationen anhand verschiedener Marker nachweisen lassen. Einige Verfahren sind noch im experimentellen Stadium, u.xa0a. Genexpressionsmuster in Kumuluszellen oder die Konzentration bestimmter Metabolome im Kulturmedium. Ein weiteres neues Verfahren ist der Einsatz von Time-lapse-Imaging zur Korrelation morphokinetischer Parameter mit Aneuploidien.AbstractChromosomal aberrations such as aneuploidies are usually diagnosed by polar body biopsy or biopsy of the blastomeres or trophectoderm cells. However, several other methods are available for further diagnosis. Trophectoderm biopsy followed by array-CGH is the most favored diagnostic method, although next-generation sequencing is becoming a viable alternative. All these techniques are invasive but enable a proper diagnosis of aneuploidy. Alternate methods are discussed that may avoid the invasive removal of embryonic cells. The purpose of these new tools is to give a risk estimate for aneuploidy by correlation of different markers. Some of these technologies are still experimental; for example, gene expression in cumulus cells or concentration of certain metabolites in culture medium. A new method that is currently applied is time-lapse imaging, which allows one to correlate morphokinetic parameters with the aneuploidy risk.