Manfred Gersch

Untersuchungen ber die Bedeutung der Nucleolen im Zellkern

Zusammenfassung1.Das Ziel dieser Untersuchung war, den Formwechsel und den stofflichen Aufbau der Nucleolen eines Zelltyps an einem Objekt so weit zu erfassen, wie es die Beherrschung histochemischer und färberischer Methoden bisher zuläßt, um damit einen tieferen Einblick in die Bedeutung der Nucleolen im Zellhaushalt zu erlangen.2.Das Volumen der Zellkerne ausgewachsener, kurz vor dem Ablaichen stehender Eier von Rana temporaria und R. esculenta beträgt nach ungefähren Berechnungen das 50 000fache von dem ganz junger Oocyten. Dabei verändert sich die Nucleolarsubstanz im Verlauf der Oogenese. In jüngsten Oocyten ist nur ein Nucleolus vorhanden. Mit einsetzendem Oocytenwachstum entsteht vor allem durch Teilung und Zerschnürung zunächst eine Vielzahl von größeren und kleineren Nucleolen, die sich unregelmäßig im ganzen Kernraum verteilt finden. Im späteren Verhalten unterscheiden sich die beiden Rana-Arten hinsichtlich der Anordnung ihrer Nucleolen in den Oocyten. In den laichfertigen Eiern von Rana temporaria bleibt nur ein kleiner, zentral gelegener Komplex von verhältnismäßig wenigen Nucleolen übrig. Dagegen finden sich die Nucleolen in den Kernen von R. esculenta im gesamten Kernraum verteilt. Bei beiden Froscharten wird ihre Zahl in den Eikernen während der Periode der Dotterbildung in der Oocyte stark verringert.3.An aus der Zelle freipräparierten Kernen wurden Lösungs- und Verdauungsversuche durchgeführt. Hinsichtlich ihrer Löslichkeit lassen sich dabei die Nucleolen aus verschiedenen Kerngrößenklassen in charakteristischer Weise unterscheiden. Die daraus ableitbare stoffliche Veränderung der Nucleolarsubstanz setzt regelmäßig mit Beginn der Dotterbildung im Eiplasma ein. Die Nucleolen aus jungen Oocyten ohne Dotterbildung blieben beispielsweise resistent gegenüber Behandlung mit destilliertem Wasser, während sie aus älteren, größeren Oocytenkernen vollkommen gelöst wurden. Ähnliche Unterschiede traten bei den Lösungsversuchen mit konzentrierter NaCl-Lösung auf.4.Auf Grund der Lösungsversuche müssen die Nucleolen aus höheren Eiweißkörpern bestehen. Es wird sich wahrscheinlich um Phosphorproteide oder Phosphornucleoproteide (?) in Verbindung mit bestimmten Gerüsteiweißen handeln.Auch die speziellen Eiweißreaktionen, die an den Nucleolen ausgeführt wurden, deuten darauf bin, daß es sich um höhere Eiweißkörper handeln muß.5.In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen wurde auf histochemischem Wege nachgewiesen, daß der Kern arm oder frei von Oxydasen und Peroxydasen ist. Dagegen finden sich im Zellkern, insbesondere im Kernsaft, ebenso wie im Plasma der Oocyten Glutathion bzw. Eiweißkörper mit der SH-Gruppe. Diese Substanzen nehmen offensichtlich während der Periode der Dotterbildung zu.6.In den Nucleolen war niemals Thymonucleinsäure nachzuweisen.7.Von anorganischen Substanzen wurde Phosphor in den Nucleolen gefunden. Die Proben auf Kalium und Eisen verliefen negativ.8.Die Färbeversuche an fixierten Präparaten lassen keine eindeutigen Schlüsse über Zusammensetzung und Veränderung der stofflichen Beschaffenheit in den Nucleolen zu. Ebensowenig vermögen die allgemein gebrauchten Ausdrücke „basophil“ und „oxyphil“ eine spezifische Reaktion dieser Strukturen zu bezeichnen, denn die Nucleolen färbten sich teilweise je nach vorangegangener Fixierung sowohl mit basischen als auch mit sauren Farbstoffen, bzw. sie nahmen aus Farbstoffgemischen einmal die saure, ein andermal die basische Komponente an.Dagegen ergaben die Färbeversuche mit gepufferten Farblösungen, daß die Nucleolen aus den jungen Oocyten einen anderen IEP besitzen als die aus älteren Eiern. Der IEP der ersteren liegt etwa bei ph 4,4, der der anderen etwa bei ph 3,6. Somit wird auch mit dieser Methode der Unterschied zwischen den Nucleolen jüngerer Eier und denen älterer ersichtlich.9.Die Nucleolen stellen offensichtlich Gebilde dar, die je nach der betreffenden Zellart einen spezifischen Stoffwechsel erfahren, und die Material für zelluläre Prozesse liefern. Man kann in diesen Strukturen nach allem nicht abgelagerte bzw. unverwertbare Substanzen erblicken.

Experimentelle Untersuchungen ber den Verdauungstraktus der Larve von Chaoborus (Corethra)

Zusammenfassung1.Es wurde durch Markierung mit Hilfe der Vitalfärbung nachgewiesen, daß die Verdauungssäfte bei der Larve von Chaoborus vom Mitteldarm in den Pharynx gepumpt werden, wo der Aufschluß der Nahrung erfolgt. Die Speicheldrüsen spielen demgegenüber für die enzymatische Auflösung offenbar nur eine untergeordnete Rolle.2.Als Verschluß des Pharynx zum Oesophagus dient ein Reusenapparat, als Verschluß des Mitteldarms zum Oesophagus die Valvula cardiaca, deren feiner Bau hier becehrieben wird.3.Reizversuche mit Gewebebrei bei Tieren, deren Darminhalt durch Vitalfarbstoffe markiert worden war, ergaben, daß die Mitteldarmperistaltik und der Transport von Farbstoff (und Verdauungssaft) aus dem Mitteldarm in den Pharynx ohne direkte Nahrungsaufnahme ausgelöst werden kann. Bei der Perzeption des Reizes spielt vermutlich die mit Borsten ausgestattete Epipharynxspitze eine wichtige Rolle.4.Diese Reizwirkung trat nach Ausschaltung einzelner Thorakalganglien kaum noch in Erscheinung. Die wenigen positiven Fälle sind durch direkte Reizung mittels „Reizsaft“ im Mitteldarm zu erklären.5.Der bei der Ganglienausschaltung erzeugte Brenndefekt stellt für den Mitteldarm gleichfalls einen starken Reiz dar, als dessen Folge es zu heftiger Darmperistaltik und zum Übertritt von Farbstoff in den Pharynx kommt. Letzterer füllt sich dabei ebenso prall an wie sonst nur nach Nahrungsaufnahme.6.Die Ergebnisse der Reizversuche mit Gewebebrei vor und nach experimenteller Unterbrechung der Ganglienkette im Thorax sowie die Wirkungen des Brennreizes auf die Peristaltik des Mitteldarmes führen zu der Schlußfolgerung, daß der für den Verdauungsvorgang hier wichtige Transport von Verdauungssaft aus dem Mitteldarm zum Pharynx durch reflexhafte Prozesse eingeleitet wird. Die weiteren Transportbewegungen vom Mitteldarm zum Pharynx sind vermutlich durch direkte Reizung bedingt.7.Die Befunde weisen darauf hin, daß der bisher speziell für die höheren Wirbeltiere bekannte, zur Verdauung bedeutungsvolle Reflexmechanismus in ganz ähnlicher Weise auch bei Wirbellosen vorhanden sein kann.

Verteilung und Ausscheidung von Fluorescein bei Aphiden

Zusammenfassung1.Die Aphiden stellen die einzige Insektengruppe dar, die keine Malpighischen Gefäße besitzen. Da jedoch bekannt ist, daß die Malpighischen Gefäße bei den exkretorischen Vorgängen der Insekten maßgeblich beteiligt sind, wurde auf experimentellem Wege die Frage untersucht, in welcher Weise die Ausscheidung bei den Aphiden erfolgt.2.Mit Hilfe des fluoreszenzmikroskopischen Verfahrens konnte die Verteilung und die Ausscheidung des auf 2 verschiedenen Wegen in den Körper gebrachten Fluoresceins beim lebenden Tier laufend verfolgt werden.3.Nach Injektion einer kleinen Menge Fluoresceinlösung 1 ∶ 1000 mit Hilfe einer Glasmikropipette ergab sich bei allen 4 untersuchten Arten übereinstimmend, daß der Farbstoff in erster Linie von der stark ausdehnungsfähigen Rektalblase aufgenommen und von da aus ausgeschieden wird. Die Ausscheidung des Farbstoffes erfolgt überall in gleicher Weise, obgleich zwischen Pterocallis alni einerseits und den übrigen Formen andererseits bemerkenswerte Unterschiede im Bau des Darmkanals bestehen.4.Das Fluorescein wurde weiterhin auf dem Wege über das Blattgewebe durch Saugen an solchen mit dem Farbstoff getränkten Blättern in den Körper gebracht. Dabei passiert der Farbstoff nicht etwa einfach den ganzen Darm, um am After wieder ausgeschieden zu werden, sondern er tritt, offensichtlich gleich vom Ösophagus in die Hämolymphe und die Leibeshöhle aus und wird dann später wieder von der Rektalblase bis zur endgültigen Ausscheidung gesammelt. Der Darmkanal muß also nach diesen Ergebnissen gleichzeitig als Exkretionsorgan dieser Tiere angesprochen werden.5.Besonders auffällig war die scharfe Trennung zwischen dem Prothorax-Kopfkomplex einerseits, den übrigen Thoraxsegmenten und dem Abdomen andererseits, die sich hinsichtlich der Farbstoffverteilung sowohl nach Injektion als nach der Farbstoffaufnahme durch Saugen ergab. Durch starke Chloroformnarkose getötete Tiere zeigten demgegenüber ein völlig verändertes Färbungsbild. Fluoreszenz trat dann in allen Körperteilen und seinen Anhängen auf. Es muß sich bei diesem Phänomen um eine ganz besondere physiologische Erscheinung handeln, die unabhängig vom Zirkulationsmechanismus gewisse in der Hämolymphe befindliche Stoffe von bestimmten Körperregionen fernzuhalten vermag.6.Die Verteilung des Farbstoffes im Darm bei den einzelnen Formen war, abgesehen von der stets auftretenden Anreicherung des Fluoresceins in der Rektalblase, ungleichmäßig. Es ist sehr wahrscheinlich, daß diese gegensätzlichen färberischen Effekte durch spezifische funktionelle Unterschiede der entsprechenden Darmabschnitte bedingt sind.7.Im Gegensatz zu Fluorescein wurden die beiden basischen Fluorochrome Berberinsulfat und Coriphosphin nicht im Darmkanal bzw. in der Rektalblase angereichert. Es zeigt sich hier also ein ganz entsprechendes Verhalten, wie es bei Periplaneta in bezug auf den Mitteldarm und die Malpighischen Gefäße vorgefunden wurde.

Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen über die Ausscheidung von Farbstoffen bei Periplaneta

Zusammenfassung1.Es wurde mit Hilfe des fluoreszenzmikroskopischen Verfahrens die Aufnahme, Verteilung und Ausscheidung einiger Fluoreszenzfarbstoffe — in erster Linie von Fluorescein — bei Periplaneta americana verfolgt. Die ungeheuere Empfindlichkeit der Fluoreszenzerscheinung wurde benützt, um den Nachweis von selbst unwägbaren Spuren einer in den Organismus eingeführten Substanz und ihrer genauen Lokalisation auf optischem Wege zu erfassen.2.Fluorescein, das als Kaliumsalz in Ringer-Lösung in verschiedenen Konzentrationen durch Injektionen in den Tierkörper eingeführt wurde, eignet sich außer wegen seines distinkten Nachweisvermögens deshalb für Untersuchungen, die den Ausscheidungsmechanismus zu klären versuchen, weil dieser Farbstoff nach allen bisherigen Erfahrungen an Wirbellosen und Wirbeltiermaterial von den Emmunktorien aufgenommen und eliminiert wird. Zu der Frage, inwieweit die mit Fluorescein gewonnenen Erfahrungen auf die Ausscheidungsvorgänge der normalerweise im Körper auftretenden Stoffwechselendprodukte übertragewerden können, ist festzustellen, daß höchstwahrscheinlich analoge Verhältnisse vorliegen. Trotz einer gewissen Unsicherheit hierbei, der man sich auch durchaus bewußt bleiben muß, stellen vorliegende Injektionsversuche die einzigen Modellversuche dar, um einer Klärung dieser Fragen näherzukommen.3.Je nach der Konzentration der injizierten Fluoresceinlösung sind an der Ausscheidung des Farbstoffes beteiligt: der Mitteldarm, eine große Zahl Malpighischer Gefäße, bestimmte Zonen des Fettkörpers und ein segmental am Nervensystem aufliegender Zellkomplex, der mit dem übrigen Fettkörper große Ähnlichkeit besitzt.4.Bei Injektion von 0,1 ccm Fluoresceinlösung der Konzentration 1∶1 Million wurde der ganze Farbstoff sehr bald durch den Mitteldarm aufgenommen und über den Enddarm aus dem Körper entfernt. Durch die Malpighischen Gefäße wurde hier kein Farbstoff ausgeschieden. Damit scheint die besondere Bedeutung des Mitteldarmes für Exkretionsvorgange erwiesen.5.Durch den Vergleich der Intensität der Fluoreszenzerscheinung des im Mitteldarm angetroffenen Farbstoffes zur Fluoreszenz von Farblösungen bekannter Konzentrationen ergab sich weiterhin, daß erstere auffallend viel stärker war als die der injizierten Farblösung selbst. Ohne damit streng quantitative Bestimmungen ausführen zu können, ließ sich feststellen, daß die Farbstofflösung im Darm die Lumineszenz einer 10mal so starken Konzentration im Vergleich zur Ausgangslösung besaß. Es muß also dem Mitteldarm die Fähigkeit zur Eesorption des Wassers zuerkannt werden.6.Bei Injektionen stärkerer Lösungen (1 ∶ 100000 bzw. 1 ∶ 10000) war der Farbstoff außer im Lumen des Mitteldarmes auch im Lumen einer Anzahl Malpighischer Gefäße zu finden. Die Ausscheidung beansprucht entsprechend der höheren angebotenen Konzentration längere Zeit als bei größerer Verdünnung.7.Wurde 0,1 ccm Fluorescein 1 ∶ 1000 injiziert, so war sowohl sofort anschließend als auch längere Zeit darnach der Farbstoff im Darm, wiederum in einer Anzahl Malpighischer Gefäße und in besonderen Partien des Fettkörpers festzustellen. Außerdem trat Farbstoffaufnahme durch einen Zellkomplex ein, der sich beiderseits der Ganglienknoten, zum Teil auch ein Stück an den Längskommissuren ausdehnte. Wie die fluoreszenzmikroskopische Analyse in Verbindung mit Lebendbeobachtungen im normalen Licht und der Untersuchung von entsprechend fixierten und gefärbten Präparaten ergab, erfolgte keine Farbaufnahme in den mit Uraten angefüllten „Speicherzellen“. Das Fluorescein wurde eliminiert durch Zellen des Fettkörpers, in denen die Bildung der Exkrete erfolgte, während typische Fettzellen ungefärbt waren.8.Auffällig ist die Tatsache, daß in allen den Fällen, in denen es zu einer Farbaufnahme durch die Malpighischen Gefäße kam, stets nur ein Teil von ihnen die Lumineszenz aufwies. Dies war selbst bei der starken Konzentration 1 ∶ 1000 der Fall, bei der auch der Fettkörper angefärbt erschien. Eindeutige Gründe für diese Erscheinung ließen sich im Verlauf dieser Untersuchung bei Periplaneta nicht auffinden. Es erscheint jedoch denkbar, daß dabei Zusammenhänge mit den Ergebnissen Schlottkes bestehen, der in den Malpighischen Gefäßen von Periplaneta eine Anzahl Fermente nachweisen konnte.9.Mit Hilfe von Farbstofflösungen zweier verschiedener Farbstoffe, von denen der eine (Fluorescein) nicht oder kaum im normalen Licht bei diesen Konzentrationen, der andere (Indigokarmin) nicht im Fluoreszenzmikroskop in Erscheinung tritt, wurde gezeigt, daß die Verteilung der Farbstoffe im Lumen der Malpighischen Gefäße bei ähnlicher Konzentration gleichartig ist.10.Bei Injektion des Farbgemisches, bei der die Indigokomponente in sehr viel stärkerer Konzentration vorhanden war, fand sich im Lumen der Malpighischen Gefäße zunächst nur Indigokarmin, während das Fluorescein zu dieser Zeit in den Epithelzellen deponiert war. Später erfolgte der Übertritt auch des Fluoresceins in das Gefäßlumen. Die Tatsache, daß das Fluorescein entgegen dem Konzentrationsgefälle von den Epithelzellen in das Lumen übertritt, weist auf eine besondere Zellaktivität hin. Gleichzeitig ist mit dieser durch die Blockierung des Gefäßlumens erzwungene Epithelfärbung gezeigt, daß, jedenfalls für Fluorescein, der Durchtritt nicht in einer veränderten Konstitution vor sich geht.11.Im Gegensatz zu den Injektionsversuchen mit Fluorescein kam es bei entsprechenden Versuchen mit den fluoreszierenden Farbstoffen Coriphosphin, Trypaflavin, Thioflavin und Berberinsulfat zu ganz anderen Erscheinungen. Meistenteils erfolgte diffuse Anfärbung des Plasmas der Organe. Mit Coriphosphin trat eine vitale Kernfärbung vor allem in den Epithelzellen der Malpighischen Gefäße ein. Da aber hier ganz andere Voraussetzungen für diese Färbungserscheinungen vorliegen als sie für vorliegende Untersuchung zu fordern waren, wurde diesen Phänomen nicht weiter nachgegangen.

Vitalfärbung als Mittel zur Analyse physiologischer Prozesse

ZusammenfassungDie vitale Färbung diente zur Analyse der physiologischen Veränderungen im Plasma unter natürlichen und sauerstoffarmen Außenbedingungen.Bei extremem Sauerstoffmangel verschiebt sich das pH der vital färbbaren Plasmaphase von normal pH 6,7–6,9 bis zu etwa pH 8. In noch stärkerem Maße ist das Redoxpotential im Plasma vom Sauerstoffgehalt des Kulturwassers abhängig; es sinkt ganz kontinuierlich bei zunehmender Sauerstoffarmut des Wassers von rH=21 bis zu rH=6. Dagegen besteht keine Abhängigkeit des pH und rH von der Wasserstoffionenkonzentration des Kulturwassers innerhalb der erträglichen Grenzen.Die Erscheinungen der Nahrungsvakuolen-, Granula- und Plasmadiffusfärbung sind, abgesehen von der Natur des Farbstoffs, in erster Linie von dessen Konzentration abhängig.Die von Pütter, v. Brand u. a. behauptete fakultative Anoxybiose vonParamaecium besteht nicht. Die Tiere vermögen sich dagegen an sehr niedrige Sauerstoffspannungen anzupassen. Dabei werden wahrscheinlich Plasmasubstanzen ebenso wie auf experimentellem Wege in die Zelle gebrachte Fremdsubstanzen reduziert.Die Tiere besitzen eine deutlich ausgeprägte Polarität in Hinsicht auf das Oxydations-Reduktionsvermögen: der vordere Pol ist führend in allen Oxydationsprozessen, während alle Reduktionsprozesse am hinteren Pol beginnen. Es ergibt sich damit ein von vorn nach hinten verlaufendes „Gefälle“, das evtl. bei der von anderen Autoren festgestellten reizphysiologischen Polarität vonParamaecium eine Bedeutung besitzt.Die vitale Makronukleusfärbung mit der Leukobase des Thionins wird beschrieben und Möglichkeiten zu ihrer Erklärung werden erörtert.

Gibt das fixierte Präparat ein Äquivalentbild der lebenden Zelle

ZusammenfassungEs wird versucht, die Ergebnisse von Vitalfärbungen mit basischen und sauren Farbstoffen zu histologischen Strukturfärbungen an toten und fixierten Präparaten in Beziehung zu setzen. Frühe Embryonalstadien von Aplysia sind für einen solchen Vergleich der verschiedenen Färbungsergebnisse besonders geeignet, da hier mit der Eireifung eine Plasmasonderung und polare Differenzierung einsetzt, die zu auffallenden Unterschieden in der vitalen und histologischen Färbbarkeit des animalen und vegetativen Materials führt.Vitalfärbungen mit Indikatoren ergaben für das animale Polplasma bzw. für das sich davon ableitende Mikromerenplasma ein pH von etwa 8, für das vegetative Material und die Makromeren ein pH von 6. Dementsprechend wurden basische Farbstoffe besonders stark und rasch von der vegetativen Eihälfte bzw. den Makromeren aufgenommen, während saure Farbstoffe nur die Mikromeren anfärbten. Im fixierten Präparat ist im Bereich des animalen Polplasmas ein besonders basophiles Ergastoplasma festzustellen, während das vegetative Material nun stark oxyphil wurde.Der I.E.P. entspricht nach Alkoholfixierung bei dem Ergastoplasma bzw. dem Mikromerenplasma einem pH von 4,5, bei dem Makromerenplasma einem pH von 6,2 und bei dem Chromatin von 3,7.Nach Hitzefixierung verschieben sich die Werte in folgender Weise: der I.E.P. des Ergastoplasmas entspricht einem pH von 3–4,5, der des Chromatins von 4,5–5,0 und der des vegetativen Materials von 6,2.Es ergibt sich daraus, daß die Fixierung keineswegs eine für alle Phasen und Strukturen des lebenden Systems gleichsinnige und gleichmäßige Veränderung der Färbbarkeit bewirkt, sondern daß jede Phase für sich unabhängig von anderen spezifisch beeinflußt werden kann, so daß es unmöglich wird, aus den färberischen Eigenschaften toter Strukturen auch nur relative Rückschlüsse auf die Färbungserscheinungen in den lebenden Systemen zu ziehen. Diese Unterschiede in der Färbbarkeit sind nicht nur durch die mit dem Zelltode eintretende Erhöhung der Permeabilität und größere Farbstoffabsorption, auf ein Erlöschen bestimmter an Zelltätigkeit gebundener Speicherungsprozesse in toten Zellen zu erklären, sondern das „Ladungsmosaik“ des fixierten Präparates ließ keine Beziehungen zum „pH-Mosaik“ der lebenden Zellen erkennen.

Modellversuche mit dem Nirensteinschen „Lipoidmodell” zu Vitalfärbungen anParamaecium mit pH- und rH-Indikatoren

ZusammenfassungDie von Nirenstein aufgestellte Hypothese, daß die „lebende Substanz des Zellkörpers vonParamaecium gegenüber Farbstoffen sich so verhält, als ob sie ein flüssiges Neutralfett wäre, das einen gewissen Betrag Fettsäure und fettlöslicher organischer Base enthält“, wird mit einer Anzahl pH- und rH-Indikatoren nachgeprüft. Es ergab sich keine Übereinstimmung zwischen den Farbstoffen, die vital anfärben und denen, die maximal in das Modellgemisch eindringen. So kann z. B. Methylrot-Natrium ebenso wie die vital nicht anfärbende Rosolsäure maximal von Ölsäure ausgeschüttelt werden. Chlorphenolrot und Bleu de Poirrier dringen nicht sichtbar in das Gemisch ein, während alle anderen Indikatoren deutlich im Modell festgestellt wurden.Die Nirensteinsche Auffassung stellt demnach keine allgemeingültige Erklärungsmöglichkeit für das verschiedene Verhalten saurer, lipoidunlöslicher und basischer, lipoidlöslicher Farbstoffe bei der vitalen Färbung dar, sondern kann vielleicht nur für bestimmte granuläre Speicherungsvorgänge angeführt werden.