Mireia Jové

Palmitate-Mediated Downregulation of Peroxisome Proliferator–Activated Receptor-γ Coactivator 1α in Skeletal Muscle Cells Involves MEK1/2 and Nuclear Factor-κB Activation

The mechanisms by which elevated levels of free fatty acids cause insulin resistance are not well understood. Previous studies have reported that insulin-resistant states are characterized by a reduction in the expression of peroxisome proliferator–activated receptor-γ coactivator (PGC)-1, a transcriptional activator that promotes oxidative capacity in skeletal muscle cells. However, little is known about the factors responsible for reduced PGC-1 expression. The expression of PGC-1 mRNA levels was assessed in C2C12 skeletal muscle cells exposed to palmitate either in the presence or in the absence of several inhibitors to study the biochemical pathways involved. We report that exposure of C2C12 skeletal muscle cells to 0.75 mmol/l palmitate, but not oleate, reduced PGC-1α mRNA levels (66%; P < 0.001), whereas PGC-1β expression was not affected. Palmitate led to mitogen-activated protein kinase (MAPK)–extracellular signal–related kinase (ERK) 1/2 (MEK1/2) activation. In addition, pharmacological inhibition of this pathway by coincubation of the palmitate-exposed cells with the MEK1/2 inhibitors PD98059 and U0126 prevented the downregulation of PGC-1α. Furthermore, nuclear factor-κB (NF-κB) activation was also involved in palmitate-mediated PGC-1α downregulation, since the NF-κB inhibitor parthenolide prevented a decrease in PGC-1α expression. These findings indicate that palmitate reduces PGC-1α expression in skeletal muscle cells through a mechanism involving MAPK-ERK and NF-κB activation.

Impaired expression of NADH dehydrogenase subunit 1 and PPARγ coactivator-1 in skeletal muscle of ZDF rats restoration by troglitazone

Type 2 diabetes has been related to a decrease of mitochondrial DNA (mtDNA) content. In this study, we show increased expression of the peroxisome proliferator-activated receptor-α (PPARα) and its target genes involved in fatty acid metabolism in skeletal muscle of Zucker Diabetic Fatty (ZDF) (fa/fa) rats. In contrast, the mRNA levels of genes involved in glucose transport and utilization (GLUT4 and phosphofructokinase) were decreased, whereas the expression of pyruvatedehydrogenase kinase 4 (PDK-4), which suppresses glucose oxidation, was increased. The shift from glucose to fatty acids as the source of energy in skeletal muscle of ZDF rats was accompanied by a reduction of subunit 1 of complex I (NADH dehydrogenase subunit 1, ND1) and subunit II of complex IV (cytochrome c oxidase II, COII), two genes of the electronic transport chain encoded by mtDNA. The transcript levels of PPARγ Coactivator 1 (PGC-1) showed a significant reduction. Treatment with troglitazone (30 mg/kg/day) for 15 days reduced insulin values and reversed the increase in PDK-4 mRNA levels, suggesting improved insulin sensitivity. In addition, troglitazone treatment restored ND1 and PGC-1 expression in skeletal muscle. These results suggest that troglitazone may avoid mitochondrial metabolic derangement during the development of diabetes mellitus 2 in skeletal muscle.

Avasimibe and atorvastatin synergistically reduce cholesteryl ester content in THP-1 macrophages.

Evidence suggests that the inhibition of both acyl-CoA:cholesterol acyltransferase and hydroxymethyl glutaryl-CoA reductase causes a synergistic direct antiatherosclerotic effect on the vessel wall. To investigate this synergism in a single cell type and to avoid the confounding effect of plasma cholesterol lowering by these drugs, we have used an in vitro model of human macrophages (phorbol ester-treated THP-1 cells). In macrophages incubated simultaneously with acetyl low-density lipoproteins, the novel acyl-CoA:cholesterol acyltransferase inhibitor avasimibe (0.01-0.5 microM) caused a concentration-dependent reduction in cell cholesteryl ester content that was not accompanied by an increase in intracellular free cholesterol. A 5 microM concentration of atorvastatin enhanced by approximately twofold the ability of 0.5 microM avasimibe to reduce the mass of esterified cholesterol, and this was reversed by co-incubation with 200 microM mevalonate or 10 microM geranyl-geraniol. Based on these data, we propose that the synergism between acyl-CoA:cholesterol acyltransferase and hydroxymethyl glutaryl-CoA reductase inhibitors found in several in vivo studies may be explained by a direct additive effect of both agents reducing the lipid content of the macrophages present in the lesion area.

Efecto de los agonistas PPAR sobre los valores de ARNm de genes implicados en el metabolismo lipídico de macrófagos humanos

Fundamento Los receptores activados por proliferadores peroxisomicos (peroxisome proliferator-activated receptors [PPAR]) desempenan un papel fundamental en el control del metabolismo lipidico de los macrofagos. El objetivo del presente estudio ha sido determinar los efectos de 3 activadores de PPAR (bezafibrato, fenofibrato y troglitazona) sobre las concentraciones de ARNm de genes implicados en el metabolismo lipidico de macrofagos humanos y celulas espumosas. Material y metodos Se han utilizado cultivos primarios de monocitos humanos separados por centrifugacion en gradiente de densidad a partir de buffy coats de donantes. Los monocitos asi obtenidos se cultivan en suero humano inactivado durante 10 dias para permitir su maduracion a macrofagos y, posteriormente, se convierten en celulas espumosas por exposicion a lipoproteinas de baja densidad acetiladas (150 ag/ml) durante 48 h. Los valores de ARNm se determinaron mediante reaccion en cadena de la polimerasa de la transcriptasa inversa (RT-PCR). Los resultados se expresan como la media ± desviacion estandar de 3 experimentos. Resultados Los macrofagos humanos tratados durante 24 h con bezafibrato 100 dM, un farmaco que activa los 3 subtipos de PPAR (a,///y y), mostraron un incremento en los valores de ARNm de cd36 y ap2 del 87% (p 0,01) y el 230%, respectivamente, mientras que las expresiones de PPAR, PPAR, acil- CoA oxidasa, carnitina palmitoiltransferasa I (CPT-I), ATP-binding cassette transporter 1 (abcd1), colesteril ester hidrolasa neutra y lectin-like oxidized low density receptor-1 (lox-1) no resultaron modificadas. Por el contrario, el tratamiento con agonistas selectivos pparpp(100 (M de fenofibrato) y mm(5 (M de troglitazona) provoco diferentes efectos. El fenofibrato incremento los valores de ARNm de PPARii(el 62%; p 0,05) y lox-1 (el 180%; p 0,05), mientras que la troglitazona aumento la expresion de CPT-I (el 75%; P 0,05). Cuando se estudio el efecto de estos farmacos en las celulas espumosas derivadas de macrofagos, se observo que la troglitazona incrementaba un 134% (P 0,05) y un 66% (P 0,01) los valores de ARNm de abca1 y CPT-I, respectivamente, mientras que los 3 farmacos estudiados incrementaron de forma significativa los valores de ap2 (aproximadamente, un 100%). Puesto que la troglitazona incrementaba la expresion de genes implicados en la e-oxidacion mitocondrial de acidos grasos (CPT-I), asi como en el transporte reverso de colesterol (abca1), se determino si estos cambios afectaban a la acumulacion intracelular de esteres de colesterol. En celulas espumosas derivadas de macrofagos se observo una reduccion (el 32%; P 0,01) en la acumulacion intracelular de colesterol tras el tratamiento con troglitazona, pero no tras el tratamiento con bezafibrato o fenofibrato. Conclusion Se necesitan estudios complementarios para establecer si la induccion en la expresion de CPT-I por la troglitazona reduce la disponibilidad de acidos grasos necesarios para la sintesis de esteres de colesterol y la formacion de las celulas espumosas.

Avasimibe, un nuevo inhibidor de la ACAT, y atorvastatina actúan sinérgicamente reduciendo el contenido de ésteres de colesterol en macrófagos humanos THP-1

Fundamento y objetivo Existen evidencias de que la inhibicion conjunta de la acil-CoA:colesterol aciltransferasa (ACAT) y de la hidroximetil glutaril- CoA (HMG-CoA) reductasa produce un efecto antiaterosclerotico directo de forma sinergica en la pared vascular. El objetivo de este estudio ha sido determinar el efecto de un nuevo inhibidor de la ACAT (avasimibe), solo o en combinacion con un inhibidor de la HMG-CoA reductasa (atorvastatina), sobre la acumulacion de esteres de colesterol en un modelo in vitro de macrofagos humanos Metodos Los macrofagos THP-1 se incubaron de dos formas: a) simultaneamente con LDL acetiladas y el(los) farmaco(s) en presencia y en ausencia de HDL durante 48 h, o b) en una primera fase con LDL acetiladas, para permitir la carga lipidica, seguido de una incubacion con el farmaco en presencia de HDL durante otras 48 h (incubacion secuencial). A partir del lisado celular se extrajeron los lipidos y se determinaron los contenidos de colesterol libre y total por cromatografia de gases. El contenido en esteres de colesterol se calculo por diferencia entre el colesterol total y el libre. La viabilidad celular se determino por el metodo de MTT Resultados En macrofagos incubados simultaneamente con LDL acetiladas, avasimibe (0,01-0,5 µM) produjo una disminucion dependiente de la concentracion del contenido de colesterol esterificado, que no fue acompanada de un incremento en el colesterol libre intracelular. La adicion de atorvastatina 5 µM potencio alrededor de 2 veces la capacidad de avasimibe 0,5 µM de reducir la masa de colesterol esterificado, efecto que fue revertido por la adicion de mevalonato 200 µM o geranil-geraniol 10 µM Conclusiones En funcion de estos datos, se propone que el sinergismo entre inhibidores de la ACAT y de la HMG-CoA reductasa descrito en algunos estudios in vivo se podria explicar por un efecto aditivo directo de los dos farmacos en la reduccion del contenido lipidico de los macrofagos presentes en el area de lesion ateromatosa