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Reduction of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) related nuclear factor-kappaB (NF-κB) translocation but not inhibitor kappa-B (Iκ-B)-degradation by Rho protein inhibition in human endothelial cells

Abstract Degradation of inhibitor kappa-B (Iκ-B) followed by translocation of nuclear factor-kappaB (NF-κB) into the nucleus and activation of gene expression is essential in tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)-signaling. In order to analyze the role of Rho proteins in TNF-α-induced NF-κB-activation in human umbilical cord vein endothelial cells (HUVEC) we used Clostridium difficile toxin B-10463 (TcdB-10463) which inactivates RhoA/Rac1/Cdc42 by glucosylation and Clostridium botulinum C3-toxin which inhibits RhoA/B/C by ADP-ribosylation. Exposure of HUVEC to 10xa0ng/mL TcdB-10463 or 2.5xa0μg/mL C3-toxin inhibited TNF-α (100xa0ng/mL)-induced expression of a NF-κB-dependent reporter gene. Moreover, preincubation of HUVEC with 10xa0ng/mL TcdB-10463 reduced TNF-α-related expression of interleukin-8 (IL-8), TNF-receptor associated factor-2 (TRAF2), and human inhibitor of apoptosis protein 1 ( hIAP1 )-mRNA. Blocking of Rho reduced NF-κB DNA-binding as shown by electrophoretic mobility shift assays. TcdB-10463 and C3-toxin blocked TNF-α-related nuclear translocation of NF-κB although Iκ-Bα/β was still degraded. In contrast, TcdB-10463 had no effect on IL-1β-related NF-κB-translocation and activation in HUVEC. Neither 1xa0μM Rho kinase inhibitor Y-27632 nor microfilament depolymerization by 50xa0ng/mL C. botulinum C2-toxin blocked TNF-α-induced degradation of Iκ-B, nuclear NF-κB translocation or expression of a NF-κB-dependent reporter gene. Therefore, TNF-α-related Iκ-B-degradation is Rho-independent in HUVEC, whereas a Rho protein-dependent signal is necessary to induce nuclear transport of NF-κB in these cells pointing to a novel and unique role of Rho in NF-κB-translocation.

Homogeneous assay based on 52 primer sets to scan for mutations of the ABCA1 gene and its application in genetic analysis of a new patient with familial high-density lipoprotein deficiency syndrome.

Familial high-density lipoprotein (HDL)-deficiency syndromes are caused by mutations of the ABCA1 gene, coding for the ATP-binding cassette transporter 1. We have developed a homogeneous assay based on 52 primer sets to amplify all 50 ABCA1 exons and approximately 1 kb of its promoter. The assay allows for convenient amplification of the gene from genomic DNA and easy mutational analysis through automatic sequencing. It obviates the need to use mRNA preparations, which were difficult to handle and posed a risk to miss splice junction or promoter mutations. The application of the test to the molecular analysis of a new patient with familial HDL-deficiency (Tangier disease) led to a discovery of two novel ABCA1 mutations: C2665del and C4457T.

A Severe Case of Leptospirosis Acquired During an Iron Man Contest

into noninflamed meninges, resulting in a lack of bactericidal effect. None of the beta-lactam agents penetrates well into noninflamed meninges, yet meningitis has not been reported after treatment with penicillins, possibly because penicillins are usually more bactericidal against pneumococci than the early cephalosporins. Two cases have been reported of pneumococcal meningitis that occurred in children treated with macrolides for acute otitis media [3, 4]; however, unlike the present case, both were caused by macrolideresistant pneumococci.

Regulation of NGF and BDNF by dexamethasone and theophylline in human peripheral eosinophils in allergics and non-allergics

BACKGROUNDnRecent studies have shown that the neurotrophins NGF and BDNF are produced by eosinophils. The influence of neurotrophins in allergic diseases including asthma has been described. The regulation by pharmacological substance remains unclear.nnnOBJECTIVESnThe aim of this study was to assess whether approved pharmacological substances in the treatment of asthma such as corticosteroids or theophylline regulate neurotrophins on a cellular level.nnnMETHODSnEosinophils were purified by negative immunoselection from allergics and non-allergic donors. Eosinophils were incubated with dexamethasone and theophylline and supernatants were collected for measurement of neurotrophic factors. The content of neurotrophins in eosinophil lysates was determined by ELISA. Regulation of stored NGF and BDNF was demonstrated by Western-blotting and flow cytometry while influence on transcription level was demonstrated by RT-PCR.nnnRESULTSnEosinophils produce and release the neurotrophins NGF and BDNF at different levels in allergics and non-allergics. Dexamethason lead to a significant downregulation of NGF in eosinophils of allergics. The levels of BDNF were not significantly reduced. Theophylline did not influence the levels of NGF nor BDNF significantly.nnnCONCLUSIONSnThe production of the neurotrophin NGF was downregulated by an established substance such as dexamethasone. This might further contribute to the pharmacological potential of corticosteroids in allergic asthma.

Pulmonary artery endothelial cells.

Endothelial cells function as a highly regulated barrier between blood and interstitium. They play a central role in the regulation of vascular permeability by controlling the passage of liquid and nutrients as well as the transit of white blood cells (1,2). The endothelium is involved in the inflammatory response by either secreting cytokines or responding to blood-derived mediators or signals from adjacent cells (3-6). In 1973, Jaffe and coworkers (7) first published the culture of endothelial cells isolated from human umbilical veins. Ryan and coworkers (8) described, in 1978, the first isolation of pulmonary artery endothelial cells. Porcine endothelial cells have been used to study endothelial permeability in vitro (2,10,9) adhesion (11), and blood coagulation (12). Since the regulation of endothelial permeability is critical for pulmonary gas exchange, the close vicinity to airway epithelial cells has drawn attention to interactions between both cell types. Here we describe the isolation and culture of pulmonary artery endothelial cells and outline the in vitro measurement of endothelial permeability.

Ventilator-induced lung injury: Intermedin reduziert pulmonalvaskuläre Permeabilität im Mausmodell

Die maschinelle Beatmung birgt das Risiko, Lungenschaden (ventilator-induced lung injury; VILI) zu verursachen oder zu aggravieren. Insbesondere in vorgeschadigten Lungen konnen lungenprotektive Beatmungsstrategien VILI limitieren, jedoch nicht verhindern. Adjuvante pharmakologische Interventionen konnten VILI uber protektive Beatmung hinaus reduzieren. In vitro-Studien legen barrierestabilisierende Eigenschaften des endogenen Peptids Intermedin (IMD) nahe. Humane umbilikalvenose Endothelzellen (HUVECs) wurden mit IMD inkubiert und der transendotheliale elektrische Widerstand (TER) als Mas der Integritat der endothelialen Barriere gemessen. Der Einfluss von Beatmung auf die pulmonale Expression von endogenem IMD, CRLR und RAMP1–3 wurde mittels qPCR und Immunhistochemie analysiert. Ferner wurden Mause mit Tidalvolumina von 12ml/kg fur 6h beatmet und mit IMD (25µg/kg x h) oder Placebo behandelt. In HUVECs fuhrte IMD zur Stabilisierung der endothelialen Barrierefunktion. Beatmung induzierte pulmonalvaskulare Hyperpermeabilitat und eine pulmonale und systemische Inflammation. Endogenes IMD und seine Rezeptorkomplexe aus CRLR und RAMP1–3 waren im pulmonalvaskularen Endothel lokalisierbar. Durch Beatmung nahm die Expression von RAMP3 ab, wahrend IMD, CRLR und RAMP1–2 nicht messbar reguliert wurden. Exogenes IMD reduzierte die VILI-assoziierte Hyperpermeabilitat, ohne die Rekrutierung von Leukozyten in die Lunge zu beeinflussen. Im Rahmen dieser Untersuchung wurde unseres Wissens nach erstmals die Reduktion pulmonalvaskularer Permeabilitat durch IMD in vivo beobachtet.

Inhalativer Einsatz unformulierter siRNA zur pulmonalen Regulation konstitutiver und Pneumonie-induzierter Genexpression in der Maus

Einleitung: RNA Interferenz eroffnet neue therapeutische Optionen fur die Pneumoniebehandlung. Durch lokalen Einsatz von small interfering RNA (siRNA) konnte die Expression spezieller krankheitsrelevanter Gene in der Lunge gezielt reduziert werden. Die vorliegende Studie untersucht die Effektivitat intratrachealer Aerosolierung unformulierter siRNA-Molekule. Methoden: Die Funktionsfahigkeit spezifischer siRNA-Molekule wurde in Zellkulturmodellen (HUVEC-, RAW- und MHS-Zelllinien) bestatigt. Weibliche C57Bl/6Mause wurden mit S. pneumoniae infiziert. Geeignete siRNA-Molekule (AtuRNAi) wurden als Tropfchen intranasal (i.n.) oder als Aerosol mittels Microsprayer™ intratracheal (i.t.) appliziert. Quantifizierung der Genexpression auf mRNA-Ebene erfolgte durch TaqMan-Realtime-PCR-Analyse. Ergebnisse: Histomorphologische Untersuchungen ergaben, dass die siRNA-Verteilung im Lungengewebe nach einmaliger i.t. Aerosolierung deutlich effektiver war, als nach i.n. Applikation. Bei uninfizierten Mausen konnte nach viermaliger i.t. Aerosolierung von E-Cadherin-spezifischer siRNA im 24h-Abstand eine Expressionsreduktion der mRNA des konstitutiv bronchialepithelial exprimierten E-Cadherin-Gens um 21% festgestellt werden. Die endotheliale Expression des VE-Cadherin-Gens wurde durch aerosolierte siRNA mit Spezifitat fur VE-Cadherin nicht vermindert. Mause mit Pneumokokkenpneumonie zeigten eine pulmonale Regulation proinflammatorischer Zytokine. Die Expressionssteigerung wurde mittels Zielgen-spezifischer siRNA um mehr als 50% reduziert. Schlussfolgerung: Inhalation von siRNA ermoglicht bei Pneumonie im Mausmodell eine spezifische RNAi-vermittelte Expressionsreduktion der mRNA von Genen, deren Expression bei Pneumonie reguliert wird. Die Effizienz der verwendeten Molekule konnte moglicherweise durch geeignete Formulierung optimiert werden.

TLR2- und Nod2-vermittelte Aktivierung der PI3-Kinase reduziert durch Induktion von Krüppel-like-factor-2 (KLF2) Pneumokokken-assoziierte Expression pro-entzündlicher Gene

Bei Pneumonie kann uberschiesende Entzundung zu lebensbedrohlichen Storungen der Oxygenierung fuhren. Insbesondere die Pneumokokken-Pneumonie ist durch eine massive Freisetzung pro-entzundlicher Mediatoren gepragt. Gleichwohl ist wenig uber der Entzundung entgegenwirkende Faktoren bei Pneumonie bekannt. Wir pruften die Hypothese, dass der Transkriptionsfaktor KLF2 Pneumokokken-induzierter Epithelzellaktivierung entgegenwirkt. Infektion mit Pneumokokken induziert die Expression von KLF2 (Proteinexpression, Aktivierung eines KLF2-Reportergens) in kultivierten humanen Epithelzellen und in infizierten Mauslungen in vivo. Die Induktion von KLF2 erfolgt nach Aktivierung von transmembranaren TLR2 und zytosolischem NOD2. Stimulation der Zellen mit TLR2- oder Nod2-Liganden oder Pneumokokken fuhrt zur Phosphorylierung der regulatorischen PI3-Kinase Untereinheit p55. Blockade der Pi3-Kinase inhibiert die Expression von KLF2 (Proteinexpression, Reportergen). Dagegen ist die KLF2 Expression unabhangig von den Kinasen p38, ERK und JNK. Experimente mit transienter Uberexpression von KLF2 oder Depletion von KLF2 mittels siRNA demonstrieren, dass KLF2 der Expression NF-kappaB-abhangiger Gene entgegenwirkt. Zusammengefasst wurde a) die PI3-Kinase als Element des TLR2- und Nod2-Signalpfades identifiziert und konnte b) KLF2 einen wichtigen gegenregulatorischen Faktor zur Vermeidung uberschiesender Entzundungsreaktionen bei Pneumonie darstellen.