P. Del Vecchio

Theseus: A new software package for the handling and analysis of thermal denaturation data of biological macromolecules

A new software package (THESEUS) has been assembled for the analysis of the DSC data, Concerning the thermal denaturation of biological macromolecules. The system is useful to obtain accurate physico-chemical information, bypassing the casual and systematic errors, very common in these experiments. It can also be used for handling data from other instruments and methodologies giving thermodynamic, spectroscopic or other kind of data as a function of temperature. Because many of the researches in this field are of exploratory nature and continuously new unfolding mechanisms are described or hypothesized in the current literature, we have written and assembled this powerful and flexible program of general applicability, in order to put the operator in a position to control each step of the calculation procedure and use his own experience for choosing the better way to solve unexpected problems.ZusammenfassungBei der Analyse von DSC-Daten der thermischen Zersetzung von biologischen Makromolekülen wurde ein neues Softwarepaket (THESEUS) angewendet. Unter Umgehung der in derartigen Experimenten oft vorkommenden gelegentlichen und systematischen Fehler eignet sich dieses System, um genaue Physikalisch-chemische Informationen zu erhalten. Außerdem kann es zur Verarbeitung von Daten verwendet werden, welche von anderen Instrumenten und Methoden stammen, die thermodynamische, spektroskopische oder andere Daten als Funktion der Temperatur liefern. Da viele der Untersuchungen auf diesem Gebiet Forschungs-Charakter tragen und in der gegen-wärtigen Literatur ständig neue Dekonvolutionsmechanismen beschrieben oder angenommen werden, haben wir dieses leistungsstarke, flexible und allgemein anwendbare Programm geschrieben und umgesetzt, um den Operator in die Lage zu versetzen, jeden Phase des Rechenvorganges kontrollieren und seine eigene Erfahrung benutzen zu können, um den besten Weg zur Lösung unvorhergesehener Probleme zu finden.

Chiral recognition between enantiomeric α-aminoacids. A calorimetric study at 25°C

Homotactic and heterotactic enthalpic pair interaction coefficients were determined at 25°C from the enthalpies of dilution of binary and ternary aqueous solutions containing the L and D forms of α-aminoacids bearing alkyl chains of increasing length (alanine, α-aminobutyric acid, valine, norvaline, leucine, isoleucine and norleucine). Significant differences were found between the values of the homotactic (hDD or hLL) and heterotactic (hDL) pairwise coefficients, for the enantiomers of leucine and its isomers. The role of the zwitterionic interactions is discussed to explain the nature of the chiral recognition.

Thermal denaturation of bovine serum albumin and its oligomers and derivativespH dependence

In a previous paper, we report a preliminary DSC study on bovine (BSA) and human (HSA) serum albumins. However, at accurate HPLC analysis the commercial proteins show three peaks: Fraction V-I, probably globulins (as declared by the producers), Fraction V-II (about 15–18% of the product) and Fraction V-III that represents pure BSA or HSA. A hypothesis is that the Fraction II is a covalent dimer, or trimer or a mixture of both, generated during the scalf-life of the commercial product.Denaturation enthalpies of the purified Fraction V-III and Fraction V-II of BSA, have been determined calorimetrically, at changing thepH, and the results of both compared with those obtained on the untreated protein. Few calorimetric experiments have been also carried on a BSA monomer derivative with sulphidril group protected. Computer program have been developed for the deconvolution of exo- and endothermic effects and for the analysis of thermal denaturation profiles.ZusammenfassungIn einer vorangehenden Mitteilung wurde über eine einleitende DSC-Untersuchung von Serumalbuminen beim Rind (BSA) und beim Mensch (HSA) berichtet. Bei präziser HPLC-Analyse zeigen alle handelsübliche Proteine drei Peaks: Fraktion V-I mit wahrscheinlich Globulinen (wie vom Hersteller angegeben), Fraktion V-II (etwa 15–18% des Produktes) und Fraktion V-III, welche reines BSA oder HSA darstellt. Laut einer Hypothese handelt es sich bei der Fraktion II um ein kovalentes Dimer oder Trimer oder ein Gemisch aus beiden.Durch Änderung des pH-Wertes wurden die Denaturierungsenthalpien der gereinigten Fraktionen V-III und V-II von BSA kalorimetrisch bestimmt und die Resultate beider mit denen von unbehandelten Proteinen verglichen. Einige kalorimetrische Experimente wurden auch an einem mit einer Sulfhydrylgruppe geschützten BSA-Monomerderivat durchgeführt. Zur Dekonvolution von exo- und endothermen Effekten und zur Analyse der thermischen Denaturierungsprofile wurde ein Computerprogramm entwickelt.

Thermal denaturation of ribonuclease T1 a DSC study

The thermal denaturation of microbial Ribonuclease T1 (RNAase T1) as a function ofpH, was studied by means of DSC microcalorimetry. The midpoint denaturation temperatures, enthalpy changes and heat capacity changes of Ribonuclease T1 were compared with those obtained for pancreatic Ribonuclease A (RNAase A). It was found that the microbial T1 protein undergoes a more complex conformational transition than the simple two-state transition shown by Ribonuclease A. The hypothesis of the presence of a ‘molten globule’ form is discussed. The conformational stability of RNAase T1 is lower than that of RNAase A at highpH values. Indeed, the maximum stability of RNAase T1 occurs atpH ≈ 5, whereas that of RNAase A occurs atpH ≈ 8. AtpH=3.7 an irreversible aggregation phenomenon was indicated by the existence of a reproducible exothermic peak. The conformational transition of RNAase T1 is reversible in the range ofpH 4.5–7.0, whereas it becomes irreversible atpH≥8.0 as for RNAase A.ZusammenfassungMittels DSC Mikrokalorimetrie wurde die thermische Denaturierung von mikrobieller Ribonuklease T1 (RNAase T1) als eine Funktion despH-Wertes untersucht. Die mittleren Denaturierungstemperaturen, Enthalpieänderungen und Wärmekapazitätsänderungen von Ribonuklease T1 wurden mit denen von pankreatischer Ribonuklease A (RNAase A) verglichen. Man fand, daß das mikrobielle Protein T1 einen komplizierteren Konformationsübergang zeigt, als die bei Ribonuklease A auftretende einfache Zweizustandsänderung. Es wird weiterhin die Hypothese des Auftretens einer “geschmolzenen Kügelchen” Form diskutiert. Die Konformationsbeständigkeit von RNAase T1 ist bei hohenpH-Werten niedriger als die von RNAase A. Die größte Stabilität von RNAase T1 liegt bei einempH-Wert von etwa 5, während die von RNAase A bei etwapH=8. Bei einempH-Wert von 3.7 wird durch einen reproduzierbaren exothermen Peak das Auftreten einer irreversiblen Aggregation angezeigt. Die Konformationsänderungen von RNAase T1 sind impH-Wertbereich 4.5 bis 7.0 reversibel, die von RNAase A sind irreversibel bei einempH-Wert von mindestens 8.0.

The effect ofpH on thermal stability of globular proteins

In this study we try to re-analyze thepH dependence of thermal stability of small globular proteins. From the thermodynamic point of view a long series of calorimetric and spectroscopic investigations has shown that the decreased stability in very acidic conditions can be ascribed to entropic effects. The same conclusion is reached, from a microscopic point of view, by assuming that a binding of protons on equal and noninteracting sites takes place as a consequence of unfolding process. By linking the conformational unfolding equilibrium to the proton binding equilibrium, a model is developed that is able to describe the dependence on thepH of the thermal denaturation processes of small globular protiens. The application of the model to hen lysozyme and T4 lysozyme correctly accounts for the experimental results.ZusammenfassungVorliegend versuchen wir eine Reanalyse der thermischen Stabilität von kleinen Globularproteinen. Unter thermodynamischen Aspekten zeigte eine lange Reihe von kalorimetrischen und spektroskopischen Untersuchungen, daß die verminderte Stabilität in sehr saurem Milieu Entropie-Effekten zugeschrieben werden kann. Zu der gleichen Schlußfolgerung gelangt man unter mikroskopischen Gesichtspunkten unter der Annahme, daß an entsprechenden Stellen, die keine Wechselwirkung eingehen, infolge eines Entfaltungsprozesses die Binding von Protonen stattfindet. Durch Verbindung des Konformations-Entfaltungsgleichgewichtes mit dem Protonenbindungsgleichgewicht wurde ein Modell entwickelt, welches sich zur Beschreibung derpH-Abhängigkeit des thermischen Denaturationsprozesses von kleinen Globularproteinen eignet. Die Anwendung des Modelles an Hühner-Lysozym und T4 Lysozym erklärt korrekt die experimentellen Ergebnisse.

Interactions between hydrophilic and hydrophobic structure maker solutes. Excess enthalpies of ternary aqueous solutions of D-glucose and alcohols at 25 °C

The coefficients of the virial expansion of the excess enthalpies of ternary aqueous solutions containing D-glucose and an alcohol (ethanol,n-propanol,n-butanol andtert-butanol) were determined at 25 °C. The trend of the cross coefficients versus the self coefficients of the alcohols exhibits a maximum in accordance with the system containingtert-butanol. This behaviour is similar to that found for the interaction of the same alcohols with any other hydrophilic solute examined up to now. The results are interpreted in terms of a prevailing release of water from the structured cospheres of the alcohols.ZusammenfassungDie Koeffizienten der Virialentwicklung der Überschußenthalpien von ternären, D-Glucose und einen Alkohol (Ethanol,n-Propanol,n-Butanol,tert-Butanol) enthaltenden wässrigen Lösungen wurden bei 25 °C bestimmt. Bei dem tert-Butanol enthaltenden System wird ein Maximum erhalten, wenn die Koeffizienten der Wechselwirkung zwischen verschiedenartigen Molekülen gegen die Wechselwirkung zwischen den Alkoholmolekülen aufgetragen werden. Dieses Verhalten ist identisch mit dem, das für die Wechselwirkung der gleichen Alkohole mit anderen bis jetzt untersuchten hydrophilen gelösten Stoffen gefunden wurde. Die Ergebnisse werden interpretiert, indem ein bevorzugter Austritt von Wasser aus der strukturierten Koordinationssphäre des Alkohols angenommen wird.РезюмеПри 25° определены коэф фициенты действительного рас ширения избыточной энтальпии тройных во дных систем, содержащ их Д-глюкозу и спирт (этанол, н-пропа нол, нбутанол или трет-бутанол). Зави симость перекрестны х коэффициентов от соб ственных коэффициентов спирт ов показывает максим ум для системы с третичным б утанолом. Такая тенденция является о бщей для всех случаев взаимодействия анал огичных спиртов с как им-либо другим гидрофильным растворенным вещест вом. Полученные результа ты обсуждены на основ е преобладающего выте снения воды из структ урных косфер спиртов.

Interactions between aminoacids and alcohols in water at 25 °C

The enthalpies of dilution of ternary aqueous solutions containing an alcohol (ethanol,n-propanol,n-butanol or tert-butanol) and an aminoacid or a peptide (glycine, glycyl-glycine or glycyl-glycyl-glycine), were measured at 25 °C. The results were used to calculate pair cross interaction parameters between solutes. The coefficients of virial expansion of the excess enthalpies are compared with those referring to solutions containing the same alcohols and other structure-breaking solutes (urea, thiourea and biuret). The enthalpic pair parameter for the systems glycine-alcohols shows the same trend, as reported in the literature, for similar structure-breaking solutes, with a maximum in the cross coefficients when reported versus the self pair interaction coefficients of alcohols. The results are interpreted in terms of a prevailing release of water from the cospheres of alcohols.ZusammenfassungDie Verdünnungsenthalpien ternärer wässeriger Lösungen, die einen Alkohol (Ethanol,n-Propanol,n-Butanol odertert-Bulanol) und eine Aminosäure oder ein Peptid (Glycin, Glycil-glycin oder Glycyl-glycyl-glycin) enthalten, wurden bei 25 °C gemessen. Die erhaltenen Werte wurden zur Berechnung der Parameter der zwischen den Molekülen der verschiedenartigen gelösten Stoffe auftretenden Wechselwirkungen herangezogen. Die Koeffizienten der Virialentwicklung der Überschussenthalpien werden mit denen verglichen, die sich auf die gleichen Alkohole und andere strukturbrechende gelöste Stoffe (Harnstoff, Thioharnstoff und Biuret) enthaltenden Lösungen beziehen. Die Enthalpieparameter der Systeme Glycin-Alkohole zeigen den in der Literatur für ähnliche strukturbrechende gelöste Stoffe mitgeteilten Trend nämlich ein Maximum in der Kurve, die beim Auftragen der Koeffizienten der Wechselwirkung zwischen verschiedenartigen Molekülen gegen die Koeffizienten der Wechselwirkung zwischen den Alkoholmolekülen erhalten wird. Die Ergebnisse werden unter Annahme eines bevorzugten Austritts von Wasser aus der Kosphäre der Alkohole interpretiert.РезюмеПри 25° измерены энталь пии разбавления трой ных водных систем, содерж ащих спирт (этанол, н-пропанол, н-бу танол или трет-бутано л), аминокислоту или пеп тид (глицин, глицилгли цин или глицил-глицил-гли цин). Полученные резул ьтаты были использованы для вычисления двух пара метров перекрестног о взаимодействия межд у растворенными веществами. Коэффици енты действительног о расширения избыточной энтальпи и сопоставлены с таковыми для раство ров, содержащих анало гичные спирты, но другие раст воренные вещества (мочевину, тиомочевин у и биурет). Энтальпийн ая пара параметров для систе мы глицин спирты показале максимум на графической зависим ости в координатах перекре стные коэффициенты — собст венные коэффициенты взаимодействия спир тов, аналогично приве денной в литературе для подо бных структурно-нару шенных растворенных вещест в. Результаты объяснены на основе п ревалирующего вытес нения воды из косферы спиртов.

LIGAND-INDUCED BIPHASIC THERMAL DENATURATION OF RNAase A

DSC measurements have been accomplished in aqueous solutions of bovine pancreatic ribonuclease A (RNAase A) in the presence of subsaturating amounts of 3′ cytidine monophosphate (3′ CMP) and 2′ cytidine monophosphate (2′ CMP) atpH 5.0 and 5.5. In these conditions the experimental profiles do not conform to a one-step unfolding process. It can be emphasized, as a general phenomenon, that a strong linkage between the temperature-induced protein unfolding and the ligand binding, when the ligand is less than the saturation level, causes marked distortions from a two-state transition. A purely equilibrium thermodynamic analysis gives a correct account of this behaviour and allows to simulate calorimetric curves. It is thus possible to obtain, in an indirect manner, information about the thermodynamic parameters concerning the binding process, namely the association constant and the binding enthalpy. The values ofKb and ΔbH for 3′CMP and 2′CMP, so determined, are consistent with the literature data.ZusammenfassungBeipH 5.0 und 5.5 wurden in Gegenwart von untersättigenden Mengen von 3′Cytidinmonophosphat (3′CMP) und 2′Cytidinmonophosphat (2CMP) DSC-Messungen an einer wäßrigen Lösung von Rinderbauchspeicheldrüsen-Ribonuklease A (RNAase A) durchgeführt. Unter diesen Bedingungen stimmt der experimentelle Verlauf nicht mit einem einstufigen Entfaltungsprozeß überein. Man kann als eine generelle Erscheinung hervorheben, daß—wenn die Liganden unter dem Sättigungspegel liegen—eine enge Verbindung zwischen der temperaturinduzierten Entfaltung des Proteins und der Ligandenbindung bezeichnende Störungen aus einem Zwei-Zustands-Übergang verursachen. Eine reine thermodynamische Gleichgewichts-analyse ergibt eine korrekte Darstellung dieses Verhaltens und erlaubt die Simulation kalorimetrischer Kurven. Somit ist es möglich, auf indirekte Weise Informationen über die thermodynamischen Parameter (Assoziationskonstante, Bindungsenthalpie) des Bindungsprozesses zu erhalten. Die auf diese Weise ermittelten Werte fürKb und ΔbH von 3′CMP und 2′CMP stimmen mit den Literaturangaben überein.

Interactions between small molecules of biological interest : excess enthalpies of ternary solutions of oligomers of glycine and isomeric pentoses in water at 25° C

Enthalpies of dilution of ternary aqueous solutions containing an oligomer of glycine (glycyl-glycine and glycyl-glycyl-glycine) and one of the pentoses: L-arabinose, D-lyxose, D-ribose, D-xylose, were experimentally determined. The cross coefficients of the virial expansion of the excess enthalpies were evaluated and compared with those relative to the solutions containing the same pentoses and other structure breaking solutes (glycine, urea, thiourea, biuret). The trend of these coefficients seems to depend very little on the particular pentose, with the exception of a pronounced minimum for D-ribose. Also, the cross coefficients for each of the four pentoses studied do not seem to depend on the nature of the oligomers of glycine. The results were interpreted in terms of a prevailing release of water from the hydration cosphere of the sugars. These last substances show, once more, a behavior in water more complex than that commonly thought.

Thermodynamic characterisation of RNAase a in the presence of urea and GuHCl

It is presented a study concerning the influence of guanidinium chloride (GuHCl) and urea on thermal stability of Bovine Pancreatic Ribonuclease A (RNAase A) at differentpH values. As expected, at increasing the denaturant concentration, the protein thermostability decreases. This is shown by a decrease of both the thermodynamic parameters, temperature and heat effect, characterising the denaturation process. In order to analyse the calorimetric curves we adopt a statistical thermodynamic approach. The individual one-dimensional DSC profiles have been expanded into another dimension by varying the GuHCl concentration, so that a heat capacity surface is defined for eachpH. By means of the ICARUS program, developed in our laboratory, we accomplish a two dimensional deconvolution of the experimental data linking the binding equilibrium to the denaturation process. This analysis provides a well founded and complete statistical thermodynamic characterisation of denaturation process of RNAase A in the presence of GuHCl and allows to calculate the thermodynamic parameters associated to the binding of denaturant molecule.ZusammenfassungEs wird eine Untersuchung des Einflusses von Guanidinchlorid (GuHCl) und Harnstoff auf die thermische Stabilität von Rinderbauchspeicheldrüsen-Ribonuklease A (RNAase A) bei verschiedenenpH-Werten dargelegt. Wie erwartet sinkt die Wärmebeständigkeit des Proteins mit zunehmender Konzentration des Denaturierungsmittels. Dies wird durch ein Absinken der beiden thermodynamischen Parameter Temperatur und Wärmeeffekt gezeigt, welche den Denaturierungsprozeß charakterisieren. Zur Analyse der Kalorimeterkurven wendeten wir eine statistische thermodynamische Näherungslösung an. Die einzelnen eindimensionalen DSC-Profile wurden durch Variieren der GuHCl-Konzentration in eine andere dimension erweitert, so daß für jedenpH-Wert eine Wärmekapazitäts-Oberfläche definiert wurde. Mit Hilfe des in unserem Labor entwickelten ICARUS-Programmes konnte eine zweidimensionale Dekonvolution der experimentellen Daten erzielt werden, die das Bindungsgleichgewicht mit dem Denaturierngsprozeß verknüpft. Diese Analyse bietet eine fundierte und vollständige statistische thermodynamische Beschreibung des Denaturierungsprozesses von RNAase A in Gegenwart von GuHCl und gestattet die Berechnung der thermodynamischen Parameter bezüglich der Bindung der Moleküle des Denaturierungsmittels.