S. Schraen-Maschke

ETR-3 represses Tau exons 2/3 inclusion, a splicing event abnormally enhanced in myotonic dystrophy type I

Altered splicing of transcripts, including the insulin receptor (IR) and the cardiac troponin (cTNT), is a key feature of myotonic dystrophy type I (DM1). CELF and MBNL splicing factor members regulate the splicing of those transcripts. We have previously described an alteration of Tau exon 2 splicing in DM1 brain, resulting in the favored exclusion of exon 2. However, the factors required for alternative splicing of Tau exon 2 remain undetermined. Here we report a decreased expression of CELF family member and MBNL transcripts in DM1 brains as assessed by RT‐PCR. By using cellular models with a control‐ or DM1‐like splicing pattern of Tau transcripts, we demonstrate that ETR‐3 promotes selectively the exclusion of Tau exon 2. These results together with the analysis of Tau exon 6 and IR exon 11 splicing in brain, muscle, and cell models suggest that DM1 splicing alteration of several transcripts involves various factors.

Mis-splicing of Tau exon 10 in myotonic dystrophy type 1 is reproduced by overexpression of CELF2 but not by MBNL1 silencing

Tau is the proteinaceous component of intraneuronal aggregates common to neurodegenerative diseases called Tauopathies, including myotonic dystrophy type 1. In myotonic dystrophy type 1, the presence of microtubule-associated protein Tau aggregates is associated with a mis-splicing of Tau. A toxic gain-of-function at the ribonucleic acid level is a major etiological factor responsible for the mis-splicing of several transcripts in myotonic dystrophy type 1. These are probably the consequence of a loss of muscleblind-like 1 (MBNL1) function or gain of CUGBP1 and ETR3-like factor 1 (CELF1) splicing function. Whether these two dysfunctions occur together or separately and whether all mis-splicing events in myotonic dystrophy type 1 brain result from one or both of these dysfunctions remains unknown. Here, we analyzed the splicing of Tau exons 2 and 10 in the brain of myotonic dystrophy type 1 patients. Two myotonic dystrophy type 1 patients showed a mis-splicing of exon 10 whereas exon 2-inclusion was reduced in all myotonic dystrophy type 1 patients. In order to determine the potential factors responsible for exon 10 mis-splicing, we studied the effect of the splicing factors muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP1 and ETR3-like factor 1 (CELF1), CUGBP1 and ETR3-like factor 2 (CELF2), and CUGBP1 and ETR3-like factor 4 (CELF4) or a dominant-negative CUGBP1 and ETR-3 like factor (CELF) factor on Tau exon 10 splicing by ectopic expression or siRNA. Interestingly, the inclusion of Tau exon 10 is reduced by CUGBP1 and ETR3-like factor 2 (CELF2) whereas it is insensitive to the loss-of-function of muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP1 and ETR3-like factor 1 (CELF1) gain-of-function, or a dominant-negative of CUGBP1 and ETR-3 like factor (CELF) factor. Moreover, we observed an increased expression of CUGBP1 and ETR3-like factor 2 (CELF2) only in the brain of myotonic dystrophy type 1 patients with a mis-splicing of exon 10. Taken together, our results indicate the occurrence of a mis-splicing event in myotonic dystrophy type 1 that is induced neither by a loss of muscleblind-like 1 (MBNL1) function nor by a gain of CUGBP1 and ETR3-like factor 1 (CELF1) function but is rather associated to CUGBP1 and ETR3-like factor 2 (CELF2) gain-of-function.

Tau exon 2 responsive elements deregulated in myotonic dystrophy type I are proximal to exon 2 and synergistically regulated by MBNL1 and MBNL2

The splicing of the microtubule-associated protein Tau is regulated during development and is found to be deregulated in a growing number of pathological conditions such as myotonic dystrophy type I (DM1), in which a reduced number of isoforms is expressed in the adult brain. DM1 is caused by a dynamic and unstable CTG repeat expansion in the DMPK gene, resulting in an RNA bearing long CUG repeats (n>50) that accumulates in nuclear foci and sequesters CUG-binding splicing factors of the muscle blind-like (MBNL) family, involved in the splicing of Tau pre-mRNA among others. However, the precise mechanism leading to Tau mis-splicing and the role of MBNL splicing factors in this process are poorly understood. We therefore used new Tau minigenes that we developed for this purpose to determine how MBNL1 and MBNL2 interact to regulate Tau exon 2 splicing. We demonstrate that an intronic region 250 nucleotides downstream of Tau exon 2 contains cis-regulatory splicing enhancers that are sensitive to MBNL and that bind directly to MBNL1. Both MBNL1 and MBNL2 act as enhancers of Tau exon 2 inclusion. Intriguingly, the interaction of MBNL1 and MBNL2 is required to fully reverse the mis-splicing of Tau exon 2 induced by the trans-dominant effect of long CUG repeats, similar to the DM1 condition. In conclusion, both MBNL1 and MBNL2 are involved in the regulation of Tau exon 2 splicing and the mis-splicing of Tau in DM1 is due to the combined inactivation of both.

Altered splicing of Tau in DM1 is different from the foetal splicing process

Among the different mechanisms underlying the etiopathogenesis of myotonic dystrophy type 1 (DM1), a backward reprogramming to a foetal splicing machinery is an interesting hypothesis. To address this possibility, Tau splicing, which is regulated during development and modified in DM1, was analyzed. Indeed, a preferential expression of the foetal Tau isoform, instead of the six normally found, is observed in adult DM1 brains. By using two cell lines, we show here that the cis‐regulating elements necessary to generate the unique foetal Tau isoform are dispensable to reproduce the trans‐dominant effect induced by DM1 mutation on Tau exon 2 inclusion. Our results suggest that the mis‐splicing of Tau in DM1 is resulting from a disease‐associated mechanism.

The novel retinoid AHPN/CD437 induces a rapid but incomplete apoptotic response in human myeloma cells☆

The synthetic retinoid 6-[3-(1-adamantyl)-4-hydroxyphenyl]-2-naphthalene carboxylic acid (AHPN/CD437) appears to possess an apoptotic activity superior to classical retinoids in vitro as in vivo. Numerous studies have shown that CD437-induced apoptosis is independent of its nuclear receptor activity, suggesting that CD437 might have a unique mechanism of action. The purpose of this study was to compare CD437- and all-trans retinoic acid (atRA)-induced cell death. CD437 provoked a rapid apoptotic phenotype immediately followed by secondary necrosis in RPMI 8226, U266 and L363 human myeloma cell lines. Nuclear apoptotic features were observed upon both CD437 and atRA treatments. In contrast, membrane blebbing and the subsequent formation of apoptotic bodies, a classical apoptotic event, was only observed upon atRA treatment. In addition, CD437, contrary to atRA, was unable to induce tissue transglutaminase (tTG), an intracellular enzyme involved in the formation of cross-linked protein polymers contributing to apoptotic morphological changes. Taken together, these data suggest that CD437 induces rapid but incomplete apoptotic phenotype in human myeloma cells.

C13 Intérêt des biomarqueurs du LCR et d’imagerie pour le diagnostic de la maladie d’Alzheimer

Les traitements agissant directement sur les lesions pathologiques de la maladie d’Alzheimer (MA) pourraient etre d’autant plus efficaces qu’ils seraient proposes precocement, au stade prodromal. Cependant, diagnostiquer la MA reste difficile et le MMS moyen a la premiere visite en centre memoire est de moins de 20/30. Il est donc important de proposer un diagnostic fiable et precoce et les recommandations pour ce diagnostic s’appuient sur l’histoire clinique, l’examen neuropsychologique et sur les explorations paracliniques d’imagerie et/ou biologiques du liquide cephalorachidien (LCR). Les lesions pathologiques de la MA sont les degenerescences neurofibrillaires (DNF) constituees de proteines tau anormalement phosphorylees et les depots de peptides amyloides As1-40 et As1-42. Les DNF se deposent initialement au niveau du cortex entorhinal et de l’hippocampe avant de s’etendre de facon hierarchisee a l’ensemble du cerveau. En rapport avec ces lesions et la perte neuronale associee, l’atrophie hippocampique et du cortex entorhinal visible en IRM est un marqueur precoce du diagnostic de la MA et represente un facteur de risque de cette pathologie chez les patients ayant un trouble cognitif leger (ou MCI). En tomographie par emission de positons ou tomographie par emission monophotonique de perfusion, il existe des anomalies de fixation au niveau des carrefours, evocatrices du diagnostic de MA et ayant un caractere predictif pour ce diagnostic chez les patients MCI. Dans le LCR, la diminution de la concentration du peptide As1-42 et l’augmentation de la concentration des peptides T-tau et P-tau sont en faveur du diagnostic de MA. Ce profil est egalement present dans le LCR des patients MCI qui vont progresser vers une MA. Pour le diagnostic de MA, les anomalies en imagerie morphologique ou fonctionnelle ne sont pas toujours des indicateurs suffisamment specifiques. En revanche, la combinaison des resultats d’imagerie et biologiques permet d’augmenter la sensibilite et la specificite du diagnostic, aux stades prodromal et de demence de la MA. Les marqueurs plasmatiques actuels, qui sont plus facilement utilisables, ne sont pas encore sensibles et fiables pour un diagnostic mais leur cinetique pourrait avoir une valeur predictive a evaluer.

P1-19 Dérégulation de l’épissage de Tau par MBNL1 dans une Tauopathie

Introduction La degenerescence neurofibrillaire (DNF) correspond a l’agregation intraneuronale d’une ou plusieurs isoformes de proteines Tau anormalement modifiees. Cette lesion est commune a plus de vingt maladies neurodegeneratives appelees Tauopathies. Il existe plusieurs hypotheses etiologiques a la DNF dont celle d’une modification de l’epissage de Tau. Nous avons montre dans le cerveau de patient atteint de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1) un defaut d’epissage de Tau associe a une DNF. La DM1 est une maladie neuromusculaire, autosomique dominante. La mutation, localisee en 3’UTR du gene dmpk, se caracterise par des repetitions CTGn>50. Les ARNs mutants sequestrent des proteines dont le facteur d’epissage MBNL1. La consequence est une perte de fonction de MBNL1 entrainant une deregulation indirecte de l’epissage alternatif de ses cibles, dont Tau. L’objectif de notre travail vise a mieux comprendre les mecanismes lies a la deregulation de l’epissage de Tau et tenter de corriger cette deregulation. Materiel et Methodes Afin de reproduire le defaut d’epissage de Tau, nous disposons d’un minigene de Tau comprenant les exons 2 et 3 flanquees de leurs sequences introniques, d’un plasmide exprimant 960 repetitions CTG, mimant ainsi in vitro la production des ARNs mutes de la DM1 et de plusieurs isoformes de MBNL1 ainsi que des formes deletees des domaines N- ou C-terminaux de cette proteine. Nous avons preciser l’implication de MBNL1 a l’aide de ces outils moleculaires. Resultats Nous montrons in vitro que les repetitions CTG et l’invalidation de MBNL1 par siRNA reproduisent le defaut d’epissage de Tau. De plus, la surexpression de MBNL1 en presence des repetitions CTG restaure le defaut d’epissage de Tau. MBNL1 semble donc jouer un role majeur dans la regulation de l’epissage des exons 2 et 3 de Tau. Afin de preciser l’implication de MBNL1 pour l’alteration d’epissage de Tau, nous avons realise une etude structure / fonction et montrons que la region N-terminale de MBNL1 est essentielle et suffisante a la restauration de l’epissage de Tau. Conclusion/Perspectives La perte de fonction endogene de MBNL1 dans la DM1 peut etre restauree par la surexpression du domaine N-terminale de MBNL1. Elle est actuellement evaluee comme outil therapeutique dans un modele de souris transgenique DM1

O1-5 Altération des concentrations plasmatiques des peptides amyloïdes dans les formes familiales de la maladie de Parkinson

Introduction De nombreux patients parkinsoniens presentent des troubles cognitifs moderes et plus d’un tiers des sujets evolue vers une demence. Nos analyses transcriptomiques de cellules mononucleees de patients et de temoins suggerent une deregulation du metabolisme de l’amyloide au cours de la maladie. De plus, un dysfonctionnement du metabolisme de l’APP a ete associee a la demence de type parkinsonienne dans certaines etudes (Kalaitzakis et al, 2008 ; 2009). Plusieurs etudes ont montre que le rapport plasmatique de peptide Abeta1-42/Abeta1-40 dans une population sans demence est associe a une progression vers la demence. Nous avons donc recherche de potentielles variations des concentrations plasmatiques des peptides Abeta1-40 et Abeta1-42 chez des sujets Parkinsoniens, compare a des controles. Methodes 67 sujets atteints de formes familiales de maladie de Parkinson selon les criteres diagnostiques de Gibb ont ete compares a 67 temoins d’âge et de sexe similaire indemnes de signes neurologiques de maladie de Parkinson ou de demence (MMS>27). Les concentrations des peptides amyloides Abeta1-40 et Abeta1-42 ont ete mesurees a partir de plasma par la technologie xMAP et comparees entre chaque groupe par un test de Wilcoxon et selon la mediane d’âge des sujets. Resultats Alors que l’analyse globale de l’echantillon ne montrait pas de variations significatives de taux d’Abeta entre malades et temoins, les sujets parkinsoniens de moins de 56 ans, presentent une augmentation significative des concentrations du peptide amyloide Abeta1-40 (p=0,009). Chez les sujets parkinsoniens de 56 ans et plus, une augmentation non significative de Abeta1-40 est retrouvee (p = 0,051) ; et le ratio Abeta1-42/Abeta1-40 est significativement abaisse compare aux temoins (p = 0,003). Conclusion Les resultats de cette etude pilote montrent des variations de concentrations plasmatiques des peptides amyloides en fonction de l’âge des sujets parkinsoniens. Ces resultats confortent l’hypothese d’alterations du metabolisme des peptides amyloides au cours de la maladie de Parkinson. Des etudes complementaires de suivi de cohorte sont necessaires afin de confirmer ces resultats et d’etablir si la mesure des concentrations plasmatiques d’Abetaα peut contribuer au depistage des sujets parkinsoniens a risque de developper des troubles cognitifs ou une demence.

P2a-13 Biomarqueurs Tau, p-Tau et Aβ 1-42 dans le LCR : Proposition d’arbres décisionnels pour l’aide au diagnostic des démences et de la MA

Introduction Dans la Maladie d’Alzheimer (MA), des alterations specifiques du metabolisme cerebral conduisent a la formation et l’agregation de proteines anormales : les proteines Tau hyperphosphorylees et le peptide amyloide Ab42, qui constituent donc des marqueurs biologiques privilegies. La concentration de ces marqueurs dans le LCR est alteree chez les patients MA : les proteines intraneuronales Tau totales et hyperphosphorylees (phospho-Tau), voient leurs concentrations augmenter ; par contre le peptide Ab42 voit ses concentrations diminuer. Dans cette etude, nous avons recherche parmi ces trois parametres quels etaient les indicateurs majeurs pour separer les sujets dements des non-dements d’une part, et pour separer les sujets MA des autres demences d’autre part. Methodes La proteine tau totale (Tau), tau phosphorylee (Threonine 181, P-Tau) et le peptide Aβ 1-42 sont doses prospectivement depuis 2004 dans le liquide cephalo-rachidien. • Inclusion : patients de la clinique neurologique et du CMRR de Lille : 38 cas controles, 91 cas de maladie d’Alzheimer probable (MA), 57 cas ayant un trouble cognitif leger (MCI), 104 cas de demences non Alzheimer (nMA : demences vasculaires, demences a corps de Lewy, paralysies supranucleaires progressives, degenerescences corticobasales, demences fronto-temporales, demences d’autre etiologie). • Le diagnostic clinique a ete pose selon les criteres consensuels internationaux etablis grâce a l’interrogatoire, l’examen clinique, le bilan neuropsychologique et l’imagerie cerebrale. L’interrogatoire et l’examen clinique ont permis d’exclure une demence chez les controles. • Dosages : par technique ELISA (Innogenetics®, Belgique). Resultats Pour distinguer les sujets dements des controles, l’indicateur majeur est P-tau (pour une valeur seuil de 53 pg/ml), avec un apport plus mineur de la valeur d’Aβ 1-42. Pour distinguer les sujets MA des autres demences, l’indicateur majeur est P-tau (pour une valeur seuil de 70 pg/ml). Conclusion En fonction du contexte clinique, nous proposons 2 arbres decisionnels avec des valeurs seuil de p-Tau distinctes pour l’aide au diagnostic des demences et de la MA.

O2-5 Concordance de la tomographie cérébrale monophotonique de perfusion et des biomarqueurs du liquide céphalorachidien dans la maladie d’Alzheimer possible et probable

Introduction Cette etude decrit la concordance de la Tomographie cerebrale par emission monophotonique (TEMP) et des biomarqueurs du liquide cephalorachidien (LCR) pour le diagnostic de maladie d’Alzheimer (MA). Materiels et methodes Entre 2004 et 2008, 22 patients ayant une MA probable (âge moy : 68 ans, MMS 18±4) et 18 une MA possible (âge moy : 77 ans, MMS 22±4) ont beneficie d’une TEMP au 99mTc-HMPAO et d’un prelevement de LCR avec dosage des proteines T-tau, P-tau et Aβ1-42 a la premiere visite. Trente huit patients ont ete suivis cliniquement. Le diagnostic de MA probable ou possible etait pose a partir des criteres du NINCDS-ADRDA et des donnees de l’imagerie morphologique par IRM, en aveugle des resultats TEMP et LCR. L’evaluation visuelle et qualitative des images TEMP ont permis de differencier les defauts de perfusion cerebrale : i) compatible avec une MA ou ii) non compatible. Le profil des biomarqueurs du LCR etait i) en faveur d’une MA ou ii) non en faveur. Resultats MA probable : Dans 19 cas sur 22, LCR et TEMP etaient concordants. Dans un cas, seule la TEMP etait en faveur d’une MA et dans deux cas seul le profil LCR etaient en faveur de ce diagnostic. Avec le suivi, le diagnostic de MA probable a ete conserve pour les 22 patients. MA possible : Pour 18 cas, TEMP et LCR etaient concordant 8 fois, dont 5 en faveur d’une MA, diagnostic conserve avec le suivi. Parmi les cas de concordance des examens paracliniques non en faveur du diagnostic de MA, le suivi clinique a suggere de retenir le diagnostic de MA probable pour l’un des 3 patients. Des 10 cas discordants, dans un cas seule la TEMP et dans 9 cas seul le profil LCR etaient en faveur d’une MA. Le suivi clinique de ces derniers montre 7 cas de MA probable et un cas de non demence. Conclusions La concordance TEMP-LCR est bonne dans la MA probable, mais des divergences existent dans la MA possible. Le suivi clinique souligne l’interet de l’evaluation prospective de la TEMP cerebrale et des biomarqueurs du LCR dans la MA.