Thomas P. Mommsen

Die Struktur der emulgierenden Substanzen verschiedener Invertebraten

Summary1.The emulsifiers of a cricket (Gryllus bimaculatus DeGeer), two spiders (Tegenaria atrica C.L. Koch andCupiennius salei Keyserling), and a crayfish (Orconectes limosus Rafinesque) were analyzed by a simple micromethod for rapid determination of surface tension and thin-layer chromatographic separation of surface-active substances (cf. the fractionation scheme). The surface tension of deproteinized digestive fluids ranges from 34 to 37 dyn/cm (cf. Table 1). The structure of these emulsifiers appears to be fatty acyl-amino acid.2.After acid hydrolysis, a mixture of fatty acids and one or more amino acids with an equimolar ratio (exceptGryllus with a ratio of 1:1,3) were liberated (cf. Table 2). Both spectra are apparently specific for each group tested (cf. Tables 3 and 4) and different from their free fatty and free amino-acid composition in digestive fluids and tissues.In comparison with the other arthropodsOrconectes has the simplest spectrum of emulsifiers. Only taurine and a few fatty acids with 8 to 14 C atoms, including 80% decanoic acid derivatives, could be detected. The composition of the corresponding spider and insect hydrolysates are more complex with up to 14 amino acids and fatty acids from 8 to 20 carbon numbers. The major amino acid in the two spiders is glutamic acid. One acidic and two basic amino acids ofGryllus comprising 34% (mole) could not be identified, furthermore unusually high values of odd-numbered fatty acids (14% wt.) were present. Steroids were not detected in any of the cases.3.Preliminary experiments with a snail (Helix pomatia L.) point to another type of emulsifying agent, a sulfate group with fatty acids and a third substance, probably a long chain alcohol.Zusammenfassung1.Die emulgierenden Substanzen aus dem Darmsaft eines Insektes (Gryllus bimaculatus DeGeer), zweier Spinnen (Tegenaria atrica C.L. Koch undCupiennius salei Keyserling) und eines Krebses (Orconectes limosus Rafinesque) wurden isoliert und ihre Struktur als Acyl-Aminosäure-Verbindung bestimmt.Zur Aufarbeitung der Emulgatoren wurde eine einfache Mikromethode zusammengestellt, die die Messung der Oberflächenspannung in wenigen Mikrolitern und die dünnschichtchromatographische Fraktionierung der Verdauungsflüssigkeiten gestattet (vgl. das Fraktionierungsschema).Die Oberflächenspannung in den Darmsäften der untersuchten Arten beträgt nach Deproteinisierung 34–37 dyn/cm (vgl. Tabelle 1).2.Nach saurer Hydrolyse der gereinigten Emulgatoren fanden sich Gemische aus Fettsäuren und einer oder mehreren Aminosäure(n) im Mengenverhältnis 1:1 bzw. 1:1,3 beiGryllus (vgl. Tabelle 2).Fettsäure- und Aminosäurespektren sind offenbar spezifisch für die untersuchten Gruppen der Arthropoden (vgl. Tabelle 3 und 4) und von den Spektren der freien Fettsäuren und Aminosäuren in Darmsaft und Gewebe unterschieden. Bei den Krebsemulgatoren überwiegen qualitative, bei den anderen Arthropoden quantitative Unterschiede.Die Emulgatoren vonOrconectes bestehen lediglich aus Taurin und wenigen Fettsäuren mit 8–14 C-Atomen, davon 80% C-10-Fettsäuren. Die entsprechenden Spektren des Insektes und der Spinnen sind wesentlich komplexer mit bis zu 14 Aminosäuren und mit Fettsäuren von 8–20 C-Atomen. Die größte Aminosäurefraktion ist bei beiden Spinnen Glutaminsäure. Bei der Grille konnten zwei basische und eine saure Aminosäure mit zusammen 34 Mol.-% nicht identifiziert werden, ferner findet sich bei der Grille ein relativ hoher Anteil (14%) von Fettsäuren mit ungeradzahliger Kettenlänge.In keiner Fraktion mit oberflächenaktiver Wirkung konnten Steroide nachgewiesen werden.3.Erste Untersuchungen an einer Schnecke (Helix pomatia) haben ergeben, daß deren Emulgatoren weder dem Acyl-Aminosäuretyp noch der Gruppe der Gallensäuren oder-alkohole angehören, sondern aus einem bisher nicht vollständig analysierten Gemisch von Fettsäuren, Sulfat und längerkettigem Alkohol zusammengesetzt sind.

Digestive enzymes of a spider (Tegenaria at rica Koch)—I. General remarks, digestion of proteins

Abstract 1. 1. Physical properties, ionic composition, and enzymes hydrolysing protein-like substrates were analyzed in the digestive juice of a spider. 2. 2. Buffer capacity was 0.022 at the pH-value of the digestive juice (pH 7.45), mostly due to hydrolysable substances. 3. 3. Protein content was unusually high (7.05%, w/v), nearly all protein being enzyme protein; no evidence was found for the occurrence of zymogens. 4. 4. Enzymes were separated by polyacrylamide slab gel electrophoresis, and characterized by Kmapp, Vmax and pH optima, and partially by molecular weight. 5. 5. Enzymes present were: one protease hydrolysing native as well as denatured proteins: “carboxy-peptidase A”; three aryl aminopeptidase-isozymes, one being largely predominant; two amidase-isozymes hydrolysing benzoyl dl -arginine p-nitro-anilide. Furthermore, amidase activity against glutaryl l -phenylalanine p-nitroanilide and esterolytic activity against benzoyl l -tyrosyl ethyl ester could be found. 6. 6. No activity corresponding to glycylglycine dipeptidase could be detected.

Lebensweise und jahreszyklische Veränderungen des Stoffbestandes der SpinneTegenaria atrica C. L. Koch (Agelenidae)

Summary1.The annual variations in the following organic body constituents of the spiderTegenaria atrica (C. L. Koch) were studied: proteins, carbohydrates, lipids, chitin, “intermediary products” (i.e. total amino acids, total free fatty acids, low molecular carbohydrates, lactic acid), and fatty-acid and amino acid composition.2.In autumn the main constituents stored are lipids and to a lesser extent carbohydrates and proteins. Lipids and carbohydrates are used for the foodless time until spring. At the end of winter proteins and chitin are probably consumed for energy production. From the beginning of spring the concentrations of reserve substances rise again (cf. Fig. 2).The content of intermediary products is highest in winter, due to the high concentrations of free amino and free fatty acids (cf. Fig. 3). The high level of intermediary products as osmotic substances obviously makes it possible to survive low winter temperatures. This was confirmed by an experimentally induced rise in free amino acids after acclimatization to a low temperature (4 °C).3.The annual cycle of free amino acids varies according to the origin of the acids. With the exception of valine and arginine, the amount of all amino acids determined to be essential in other arthropods is lowest in winter and high in autumn and spring. In contrast, nonessential acids and valine and arginine have maximum values in winter and are responsible for the observed winter maximum in total-amino-acid determinations. The concentrations of these acids are lowest in summer (cf. Table 1, Fig. 4). In the fatty acid composition a reduction of the long chain saturated acids (at C∶22) and a rise of long chain unsaturated fatty acids (at C∶20) in winter were observed. The short chain fatty acids (≦C∶14) increase in spring (cf. Table 2).4.In summer the body compositions of males and females were compared. Only a few differences were found. The males have a higher protein content and a lower lipid content than the females. Threonine and arginine are highly concentrated in males, as is glycine in females. Finally the high amount of short chain fatty acids is striking in male animals.5.Determinations of body constituents of males in October, after the reproduction period and shortly before exitus, are characterized by an extremely wide scatter. From August to October the males lose 45% of their bodyweight. Nevertheless, a significant rise in lipid concentration, as found in females at the same time, was detected. Therefore dramatic changes in energy metabolism must be assumed.Zusammenfassung1.An der SpinneTegenaria atrica (C.L. Koch) wurden die jahreszyklischen Veränderungen folgender Stoffklassen und StoffSpektren untersucht: Proteine, Kohlenhydrate, Chitin, Lipide, „Intermediärprodukte” (Aminosäuren, Fettsäuren, niedermolekulare Kohlenhydrate, Lactat), ferner die Spektren der freien Aminosäuren und Gesamtfettsäuren.2.Im Herbst werden in erster Linie Lipide, weiterhin Kohlenhydrate und Proteine gespeichert. Lipide und Kohlenhydrate werden in der nahrungslosen Zeit bis zum Frühjahr verbraucht. Eine Verwendung von Proteinen und Chitin für den Energiestoffwechsel im späten Winter ist wahrscheinlich. Vom Frühjahr an steigen die Konzentrationen der Reservestoffe wieder an (Abb. 2).Der Gehalt an Intermediärprodukten ist im Winter am höchsten. Dies wird durch einen hohen Gehalt an freien Aminosäuren und freien Fettsäuren bedingt (Abb. 3).Ein vermuteter Zusammenhang zwischen den vermehrten Intermediärprodukten als osmotisch wirksamen Substanzen und der Fähigkeit, die tiefen Wintertemperaturen zuüberstehen, konnte durch einen experimentell induzierten Anstieg der freien Aminosäuren nach Anpassung an eine niedrige Temperatur (4 °C) bestätigt werden.3.Innerhalb des Spektrums der freien Aminosäuren gibt es zwei Gruppen, die sich unterschiedlich verändern: Der Gehalt aller für verschiedene andere Arthropoden als essentiell bestimmten Aminosäuren mit Ausnahme des Valins und des Arginins ist im Winter am niedrigsten und im Herbst und Frühjahr hoch. Alle anderen Aminosäuren (incl. Valin und Arginin) haben ein Wintermaximum (Tabelle 1 und Abb. 4) und niedrige Sommerwerte.Das Spektrum der Gesamtfettsäuren zeigt im Winter eine Reduktion der langkettig gesättigten Fettsäuren (bei C∶22) und einen Anstieg des Anteils der langkettig ungesättigten Fettsäuren (bei C∶20). Der Gehalt an kurzkettigen Fettsäuren (bis C∶14) steigt im Frühjahr stark an (Tabelle 2).4.Im Sommer wurden ♂ und ♀ vergleichend untersucht. Die Stoffspektren unterscheiden sich nur an einigen Stellen. Der Proteingehalt der ♂ ist höher als der der ♀, beim Lipidgehalt verhält es sich umgekehrt. Innerhalb des Aminosäurespektrums findet man bei den ♂ höhere Werte für Threonin und Arginin, einen erheblich niedrigeren Wert dagegen für Glycin. Auffällig ist weiterhin bei den ♂ der hohe Anteil an kurzkettigen Fettsäuren innerhalb des Gesamtfettsäurespektrums und die Menge an freien Fettsäuren.5.Der Stoffbestand der ♂ im Oktober nach der Fortpflanzungsperiode und kurz vor dem Absterben ist durch eine extrem große Streuung der Einzelmeß werte gekennzeichnet. Während der Zeitspanne von August bis Oktober verlieren die ♂ etwa 45% ihres Körpergewichtes. Dennoch findet man eine signifikante Zunahme der Lipidkonzentration, wie sie auch bei den ♀ in dieser Jahreszeit zu beobachten ist (Tabelle 3). Drastische Veränderungen im Energiestoffwechsel scheinen dem Exitus vorauszugehen.

Digestive enzymes of a spider (Tegenaria atrica koch)—II. Carbohydrases

Abstract 1. 1. Two to three α-amylases of identical molecular weight (58,000 daltons) were present in the digestive juice. The dominating isozyme degraded glycogen with a maximum velocity of 68 nkat apparent maltose/mg protein at 25°C, showed an apparent Michaelis constant of 6.43 mg glycogen/ml, and a pH optimum at pH 7.5. 2. 2. The chitinolytic system was characterized. Chitinase degraded solubilized chitin from spider or fly origin optimally at pH 6.75 at a rate of 886 nkat/mg protein; Kmapp was 0.88 mg chitin/ml. β-N-ace-tylglucosaminidase existed in two isozymes of identical molecular weight (110,000 daltons). The predominant isozyme had a pH optimum of pH 5.5, and values for Vmax and Kmappof 10.8 nkat/mg and 0.57 mM/1, respectively. 3. 3. All other carbohydrases measured showed maximum specific activities of less than 200 pkat/mg: α-glucosidase, trehalase, sucrase, β-glucosidase, β-glucuronidase. pH optimum curves, and values for Vmax and Kmapp for these enzymes are reported. 4. 4. α-glucosidase activity was competitively inhibited by Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Ki = 0.8 mM), and by p- nitrophenyl β- d - glucopyranoside . 5. 5. Hyaluronidase activity was insignificant.

Digestive enzymes of a spider (Tegenaria atrica koch)—III. esterases, phosphatases, nucleases

Abstract 1. 1. Polyacrylamide gel electrophoresis of the digestive juice revealed the presence of six carboxylic esterase isozymes—all showing identical molecular weights of about 58,000 daltons, a pH optimum at pH 8.0, and values for K m npp ranging from 0.12 to 0.26 mM/l for α-naphthyl acetate. Values for V max vary from 0.8 to 8.5 nkat/mg protein. None of the isozymes is inhibited by eserine (1.0 mM). Three isozymes could degrade long-chain fatty acyl aryl esters. 2. 2. Tributyrin and triolein were hydrolysed at the same rate as short-chain aryl esters. 3. 3. Alkaline and acid phosphatase activity could be demonstrated. Activity of the alkaline phosphatase is strongly influenced by the ionic strength of the assay medium. 4. 4. Desoxyribonuclease activity is high, similar to other invertebrates ( V max = 7.7 × 10 −3 ΔE 1 cm 260 nm sec·mg protein); the enzyme is inactive in the absence of Mg 2+ ions. 5. 5. Insignificant amounts of ribonuclease activity were detected. 6. 6. Digestive juice did not hydrolyse p -nitrophenyl sulfate.

Physiological conditions and variations of body constituents during the moulting cycle of the spider Tegenaria atrica C. L. Koch (agelenidae)

Abstract 1. Tegenaria atrica (♀ + ♂) moult 9 times to reach maturity. Two days before, a “legstriping” points to the ecdysis. 2. In the premoult stage lipids, carbohydrates, and water are high, proteins and cuticle weight are low. Immediately after ecdysis, high molecular carbohydrates decrease, amino acids increase. Within a period of 1–3 weeks after ecdysis, all organic constituents turn to the basic summer levels. 3. Changes of individual amino acids but not fatty acids are closely related to the moult, especially the tyrosine content drops sharply due to cuticle synthesis. 4. The metabolic rate is at least doubled during the foodless time prior to and after ecdysis.

Comparison of digestive α-amylases from two species of spiders (Tegenaria atrica andCupiennius salei)

Summary1.Polyacrylamide gel electrophoreses of digestive fluids reveal the presence of two to three amylases (molecular mass about 58,000 Dalton) in the webbuilding spiderTegenaria atrica, and three enzymes (molecular mass about 63,000 Dalton) in the hunting spiderCupiennius salei. In either case, one amylase is largely predominant.2.The dominating enzyme of each spider can be classified as an α-amylase (E.C.3.2.1.1) by the binding of and activation by chloride. TheKD is 1.6 mM for Cl− at 30°C. Chloride concentrations below the optimum (<10 mM) have neither effect on pH-optimum nor onKm, but lowerVmax.3.Tegenaria andCupiennius amylases show identical behaviour with respect to all kinetic parameters studied, except for temperature dependence.4.The Michaelis constants are around 4.5 mg/ml for soluble starch and for glycogen as substrates. Values forVmax are slightly higher with soluble starch than with glycogen. Total activity is in the order of 50 to 75 nkat reducing groups per mg of protein of the unfractionated digestive fluid. pH-optima are near the pH of the digestive fluid (pH 7.4).5.Discontinuous Arrhenius plots show that both amylases exist in at least two temperature-dependent conformational states. Activation enthalpy values are about 30% lower inTegenaria than inCupiennius amylases.6.The amylases appear to be calcium-dependent enzymes which are non-competitively inhibited by Hg++ and Cu++.7.Other anions activate the amylases similar to chloride, the effect decreasing with increasing iondiameter. Fluoride does neither activate nor inhibit.

Veränderung der Körperzusammensetzung und der Stoffwechselintensität der SpinneTegenaria atrica C.L. Koch (Agelenidae) nach kurzem und langem Hunger

Summary1.The following determinations were made on the spiderTegenaria atrica C. L. Koch after 3 and 7 days of starvation in spring and after 50 days of starvation in autumn: dry weight, cuticle weight, proteins, carbohydrates, lipids, and the intermediary products, free fatty and amino acids, sugars, and lactate.2.During the short starvation period, carbohydrates were reduced within 3 days to 45% and lipids to 20% of their original values. After 7 days of starvation a reduction in protein content was detectable. After 50 days starvation, the spiders had metabolized 61% of the original amount of carbohydrates, 47% of lipids, and 9% of proteins. The levels of amino acids and water as well as the weight of the cuticle remained constant during the whole starvation period.3.From the measured decomposition rates of body reserves, the metabolic rate of the spiders after 50 days of starvation was calculated to be only 17% of the normal. Taking into account the low temperature, the reserves will enable them to survive from November until the middle of March without food.Zusammenfassung1.An der SpinneTegenaria atrica C. L. Koch wurden Trockengewicht, Kutikulargewicht, Proteine, Kohlenhydrate und Lipide, sowie die Intermediärprodukte freie Fettsäuren, freie Aminosäuren, niedermolekulare Kohlenhydrate und Lactat nach 3- und 7tägigem Hunger im Frühjahr und nach 50tägigem Hunger im Herbst quantitativ bestimmt.2.In der kurzfristigen Hungerperiode werden innerhalb von 3 Tagen die vorhandenen Kohlenhydrate zu 45%, das Lipid zu 20% abgebaut. Proteinreserven werden bereits nach einer Woche angegriffen. Nach 50 Tagen Hunger sind Kohlenhydrate um 61%, Lipide um 47% und Protein um 9% ihres Ausgangswertes reduziert worden. Der Aminosäure- und Wassergehalt sowie das Kutikulargewicht bleiben generell konstant.3.Aus den gemessenen Abbauraten läßt sich errechnen, daß die Stoffwechselintensität der Spinne nach 50tägigem Hunger um 83% reduziert worden ist und daß bei niedriger Umgebungstemperatur die Reserven für eine nahrungslose Winterperiode von November bis Mitte März ausreichen.

Emulgatoren vom Alkylschwefelsäure- und Glyceridtyp im Darmsaft der WeinbergschneckeHelix pomatia L.

Summary1.From the digestive juice of the snailHelix pomatia, two fractions with surface activity ≦42 dyne/cm (calculated for the original volume) were isolated.2.Alkaline hydrolysis of the emulsifiers yields a mixture of fatty acids glycerol, sulfate, and wax alcohols (Table 2). An undecadienoic acid represents about 45% wt. of the fatty acid composition (Table 4). The major part of the alcohols, up to 83% wt., is accounted for by the hexadecanoic alcohol (Table 3).3.On the basis of the molar ratios of the components, the emulsifiers were identified as alkyl-sulfuric acid esters and partial glycerides. The glycerol is to some extent esterified with both fatty acids and sulfate. Part of the wax alcohols is present in an emulsion-stabilizing free form. Both types of emulsifiers are of technical importance and well known as components of skin creams and lotions (Lanette®), washing powders, and other emulsifying agents.Zusammenfassung1.Im Darmsaft der WeinbergschneckeHelix pomatia wurden nach chromatographischer Trennung zwei Fraktionen mit oberflächenaktiver Wirkung (≦42 dyn/cm, bezogen auf das Originalvolumen) gefunden.2.Die alkalische Hydrolyse der Emulgatoren ergab ein Gemisch aus Fettsäuren, Glycerin, Sulfat und Wachs-Alkoholen (Tabelle 2). Innerhalb der Fettsäuren dominiert mit etwa 45% eine Undec-diensäure (Tabelle 4); den überwiegenden Alkoholanteil (bis 83%) stellt Cetylalkohol (Tabelle 3).3.Auf Grund der molaren Verhältnisse der Komponenten wurden die Emulgatoren als Alkylschwefelsäureester und partielle Glyceride identifiziert, wobei das Glycerin teilweise sowohl mit Fettsäuren als auch mit Sulfat verestert ist. Ein Teil der Alkohole liegt in emulsionsstabilisierender freier Form vor. Beide Typen sind in der Technik als Bestandteile von Salben (Lanette®), Waschmitteln und anderen emulgierenden Gemischen bekannt.