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Detalhes ocultos da inibição competitiva: o que os gráficos de Lineweaver-Burk nos dizem?
Em bioquímica, um diagrama de Lineweaver-Burk (ou diagrama recíproco duplo) é uma representação gráfica da equação de Michaelis-Menten para cinética enzimática, descrita pela primeira vez por Hans Lineweaver e Dean Burk em 1934. Embora esse gráfico tenha sido historicamente amplamente utilizado para avaliar parâmetros cinéticos de enzimas, ele sofre de uma estrutura de erro distorcida em seus dados e não é uma ferramenta ideal para determinar parâmetros cinéticos de enzimas. Atualmente, métodos que utilizam regressão não linear são mais precisos e se tornaram mais acessíveis com a popularização dos computadores de mesa.
Definição do Diagrama Lineweaver-Burk
O gráfico de Lineweaver–Burk é derivado de uma transformação da equação de Michaelis–Menten. Esta equação expressa a relação entre a taxa da enzima v e a concentração do substrato a, envolvendo dois parâmetros: V (taxa limitante) e Km (constante de Michaelis). Tomando o inverso de ambos os lados desta equação, o resultado forma uma linha reta. A interceptação vertical desta linha é 1/V, a interceptação horizontal é -1/Km e a inclinação é Km/V.
Aplicações
Quando usado para determinar o tipo de inibição enzimática, o gráfico de Lineweaver-Burk pode distinguir entre inibidores competitivos, puramente não competitivos e não competitivos. Diferentes modos de inibição podem ser contrastados com respostas desinibidas.
A inibição competitiva não afetará o valor aparente de V, mas aumentará o valor aparente de Km e reduzirá a afinidade do substrato.
Inibição competitiva
A característica da inibição competitiva é que o inibidor compete com o substrato pelo sítio de ligação da enzima. Portanto, neste caso, o valor aparente de V não será afetado, mas o Km aumentará, o que significa que a afinidade entre a enzima e o substrato diminuirá. Como pode ser visto na figura, o valor do intercepto para a enzima inibida é maior do que para a enzima não inibida.
Inibição não competitiva pura
Na inibição não competitiva pura, o valor aparente de V diminuirá, enquanto Km não será afetado. No gráfico de Lineweaver-Burk, isso é refletido como um aumento na interceptação vertical, mas uma interceptação horizontal constante, indicando que a afinidade do substrato não é afetada.
Inibição Mista
A inibição não competitiva pura é na verdade muito rara, enquanto a inibição mista é muito mais comum. Sob inibição mista, o valor aparente de V diminuirá, enquanto o valor de Km geralmente aumentará, indicando que a afinidade do substrato geralmente diminuirá. Muitos estudiosos concordam com Cleland a esse respeito, reconhecendo a influência da inibição mista.
Inibição não competitiva
No caso de inibição não competitiva, o valor aparente de V diminuirá, enquanto o valor de Km não mudará. Isso é refletido na figura como um aumento na interceptação vertical, mas uma inclinação inalterada. A afinidade do substrato aumentará, em vez disso, e o valor aparente de Km diminuirá.
Deficiências
Os gráficos de Lineweaver–Burk são ruins para visualizar erros experimentais. Em particular, se o erro na taxa v tiver um erro padrão uniforme, então o erro em 1/v será muito amplo. Lineweaver e Burk estavam cientes desse problema e investigaram a distribuição de erros experimentalmente, decidindo, por fim, usar ponderação apropriada para ajuste. Entretanto, esse aspecto é quase universalmente ignorado entre aqueles que citam a "abordagem de Lineweaver e Burk".
ConclusãoOs gráficos de Lineweaver-Burk fornecem uma maneira eficaz de analisar a cinética enzimática em bioquímica, mas suas limitações não podem ser ignoradas. No ambiente tecnológico atual, o método correto de regressão não linear mostra sua superioridade. À medida que a pesquisa bioquímica avança, essas ferramentas encontrarão aplicações mais precisas?
