Language
Country/Area
No result found
1984 года по настоящее время: как метод комет стал золотым стандартом для оценки генетических повреждений
С момента его первой разработки Эстлингом и Йоханссоном в 1984 году метод кометного анализа (также известный как электрофорез в геле отдельных клеток, SCGE) постепенно стал важным инструментом для оценки повреждений ДНК. Этот простой и чувствительный метод в основном используется для обнаружения повреждений ДНК на уровне отдельных эукариотических клеток и широко применяется в различных областях, включая оценку повреждений/восстановления ДНК, биомониторинг и тестирование генотоксичности.
Кометный анализ включает в себя суспендирование клеток в агарозе с низкой температурой плавления, последующее лизирование клеток в нейтральных или щелочных условиях и подвергание суспендированных лизированных клеток электрофорезу. Метод получил свое название от кометного узора, который образует ДНК при прохождении через электрофоретический гель.
Основной процесс эксперимента с кометой
1. Шаги внедрения
Образцы клеток, взятые из клеточной культуры in vitro или у испытуемых in vivo, диспергируются в отдельные клетки и суспендируются в агарозе с низкой температурой плавления, расплавленной при 37°C. Затем эту единую суспензию наносили на предметные стекла микроскопа и накрывали покровными стеклами. Когда покровное стекло опускается на предметное стекло микроскопа, расплавленная агароза растекается, образуя тонкий слой. Затем агарозу замораживали при температуре 4°С, покровное стекло снимали, в результате чего формировалась матрица из углеводных волокон, которая инкапсулировала клетки.
2. Этап лизиса
После снятия покровного стекла предметное стекло микроскопа погружают в раствор, лизирующий клетки. Обычно используемые лизирующие растворы включают высококонцентрированный физиологический раствор и детергент, такой как Triton X-100. Функция этих компонентов заключается в разрушении клеточных белков и клеточных мембран, обнажении структуры ДНК и образовании нуклеосом со спиральной ДНК.
3. Этап электрофореза
После лизиса слайды промывают для удаления солей, а затем погружают во второй раствор — раствор для электрофореза. При приложении электрического поля отрицательно заряженные фрагменты ДНК движутся к положительному электроду до тех пор, пока они не будут очищены и помечены специфическим красителем. Разница в интенсивности хвоста кометы по сравнению с ее головой, наблюдаемая с помощью флуоресцентной микроскопии, отражает количество разрывов ДНК.
Общая структура напоминает комету, круглая голова которой соответствует неповрежденной ДНК, оставшейся в полости, а хвост представляет собой количество поврежденной ДНК. Чем ярче и длиннее хвост, тем сильнее степень повреждения.
Применение метода комет
Кометный анализ имеет широкий спектр применения, включая тестирование генотоксичности, биомониторинг человека и биоэпидемиологические исследования. Например, с помощью метода комет исследователи обнаружили, что с возрастом повреждения ДНК в нейронах и астроцитах мозга мышей значительно увеличиваются, включая множественные формы повреждений, такие как одноцепочечные разрывы и двухцепочечные разрывы.
Обнаружение фрагментации ДНК сперматозоидов
Кометный анализ также можно использовать для оценки степени фрагментации ДНК в сперматозоидах — показателя, тесно связанного с результатом экстракорпорального оплодотворения. При проведении теста проводится дополнительная процедура по разрушению прототеция сперматозоидов.
Преимущества и проблемы кометного анализа
Популярность метода кометного анализа возросла благодаря его простоте и низкой стоимости, особенно в условиях, когда более сложные тесты недоступны. Однако чувствительность этого метода также делает его восприимчивым к внешним факторам, что приводит к проблемам с воспроизводимостью результатов. Поэтому исследователям необходимо проявлять осторожность и избегать любых вмешательств, которые могут привести к повреждению или денатурации ДНК.
«Кометный анализ — высокочувствительный инструмент для оценки повреждений ДНК, но его эффективное использование зависит от обширных фоновых знаний и методов».
Будущие направления исследований
По мере развития биотехнологий неизбежно, что технология и применение кометного анализа будут развиваться вместе с ней. Исследователи изучают, как еще больше повысить точность и чувствительность теста, а также расширить его применение для различных организмов и условий окружающей среды. Таким образом, будущее кометного анализа полно проблем и возможностей.
Использование этой технологии в оценке генетических повреждений, науках об окружающей среде и медицинских исследованиях, несомненно, будет продолжать расти, наряду с более глубоким пониманием ее правильного использования и интерпретации результатов. Заглядывая в будущее, мы должны подумать о том, как обеспечить реализацию максимального потенциала этой важной технологии в улучшении здоровья человека и защите окружающей среды.
