Language
Country/Area
No result found
Магия кометного анализа: почему ДНК движется как комета при электрофорезе?
В мире науки обнаружение повреждений ДНК никогда не было легкой задачей. Однако метод электрофореза отдельных клеток с желатином (также известный как метод комет) представляет собой простой и чувствительный метод обнаружения повреждений ДНК в отдельных эукариотических клетках. Этот метод был впервые разработан Эстлингом и Йоханссоном в 1984 году, а затем усовершенствован Сингхом и др. в 1988 году. С тех пор он стал одним из стандартных методов для повреждения/восстановления ДНК, мониторинга окружающей среды и тестирования мутагенности.
Кометный анализ получил свое название от характера миграции ДНК в электрофоретическом геле, который часто напоминает комету.
Основной протокол этого анализа включает инкапсуляцию клеток в суспензию агарозы с низкой температурой плавления, затем лизис клеток в нейтральных или щелочных (pH > 13) условиях и электрофорез суспендированных лизированных клеток. В ходе этого процесса исследуется структура ДНК клетки, в результате чего формируются уникальные «кометные» узоры, отражающие степень повреждения ДНК.
Как это работает
Основной принцип метода комет заключается в том, что неповрежденная ДНК сохраняет высокоупорядоченную связь с белками матрицы в ядре клетки, и эта структура будет нарушена при повреждении ДНК. Поврежденные цепи ДНК теряют свою компактную структуру и расслабляются, начиная расширяться в агарозу. При приложении электрического поля отрицательно заряженная ДНК притягивается к положительно заряженному аноду, создавая таким образом форму «кометы».
Чем больше степень повреждения, тем длиннее и ярче будут хвосты ДНК, поскольку больше фрагментов ДНК смогут высвободиться из клетки в агарозу.
Этапы кометного анализа
Клеточная инкапсуляция
Сначала исследователям необходимо получить клетки из клеточной культуры in vitro или образцов in vivo, затем разделить эти клетки на отдельные клетки и суспендировать их в легкоплавкой агарозе, расплавленной при температуре 37°C. Затем эту суспензию отдельных клеток наносят на предметное стекло микроскопа, и по мере охлаждения она образует тонкий слой агарозы. Нейтральное осмотическое давление агарозы позволяет реагентам проникать, не влияя на положение клеток.
Трескивание
Далее слайды погружают в раствор, который вызывает лизис клеток. Этот раствор обычно содержит высококонцентрированную соль и моющее средство. Соленая вода может разрушить структуру белка внутри клеток и растворить клеточную мембрану. Таким образом, только ДНК остается нетронутой и заполняет пространство, ранее занимаемое клеткой, образуя так называемую структуру кариотипа.
Электрофорез
После лизиса клеток предметные стекла промывают для удаления избытка солей и погружают в раствор для электрофореза. Во время электрофореза приложенное электрическое поле заставляет поврежденную ДНК двигаться к аноду. Таким образом, степень повреждения напрямую влияет на диапазон миграции ДНК и, следовательно, на форму «кометы».
Эта технология обладает чрезвычайно высокой чувствительностью к повреждениям ДНК, что делает ее универсальным инструментом обнаружения.
Области применения
Кометный анализ широко используется в области тестирования генотоксичности, биомониторинга человека, молекулярной эпидемиологии и экогенетической токсикологии. Недавние исследования показали, что в процессе старения с помощью метода ДНК-комет можно обнаружить множественные типы повреждений ДНК, такие как одноцепочечные и двухцепочечные разрывы. При диагностике мужского бесплодия исследователи также могут использовать метод комет для оценки степени фрагментации ДНК в сперматозоидах.
В целом, кометный анализ представляет собой эффективный и гибкий метод обнаружения повреждений ДНК в клетках, который может сыграть уникальную роль как в фундаментальных исследованиях, так и в прикладной науке. Появятся ли в будущем по мере дальнейшего развития этой технологии более инновационные способы обнаружения и устранения повреждений ДНК, которые позволят человеческому здоровью достичь новых высот?
