Language
Country/Area
No result found
Тайна полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией: как выявить экспрессию генов через РНК?
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) — это лабораторный метод, который сочетает в себе транскрипцию РНК в ДНК (в данном случае называемую комплементарной ДНК или кДНК) и амплификацию конкретной мишени ДНК. В этом процессе используется полимеразная цепная реакция. (ПЦР). Этот метод в основном используется для измерения количества специфической РНК путем мониторинга флуоресценции реакции амплификации, называемой ПЦР в реальном времени или количественной ПЦР (кПЦР). В научной литературе термин RT-PCR иногда сбивает с толку, поскольку некоторые авторы используют его для обозначения ПЦР в реальном времени. В этой статье мы называем RT-PCR конкретно ПЦР с обратной транскрипцией.
Благодаря своей простоте, высокой специфичности и чувствительности ОТ-ПЦР использовалась в широком спектре экспериментов: от количественного определения дрожжевых клеток в вине до обнаружения инфекционных патогенов.
Принципы и применение RT-PCR
Принцип RT-PCR заключается в том, чтобы сначала преобразовать матрицу РНК в кДНК, а затем использовать ПЦР для экспоненциальной амплификации. Это революционное изменение в процессе позволяет нам обнаруживать транскрипты практически любого гена и достигать амплификации образцов, устраняя необходимость в большом количестве исходного материала при использовании нозерн-блоттинга.
От анализа экспрессии генов до диагностики инфекционных патогенов ОТ-ПЦР стала одной из важнейших технологий. Например, ученые изучают, как можно использовать RT-PCR для выявления рака, чтобы улучшить прогноз и контролировать реакцию на лечение.
Например, циркулирующие опухолевые клетки производят уникальные транскрипты мРНК в зависимости от типа рака, и RT-PCR может анализировать уровни экспрессии этих транскриптов.
Технологическая эволюция RT-PCR
С тех пор, как нозерн-блоттинг был впервые представлен в 1977 году, ОТ-ПЦР стала популярным методом обнаружения РНК и предпочтительным методом количественного определения. Этот процесс не только не требует постобработки, но и позволяет измерить более чем в 107 раз большее количество РНК, дополнительно предоставляя данные как о качестве, так и о количестве.
В настоящее время в технологии RT-PCR разработаны различные режимы работы: одноступенчатый и двухэтапный. Двухэтапная ОТ-ПЦР требует обратной транскрипции и ПЦР-амплификации в разных пробирках, тогда как однократная ОТ-ПЦР может быть выполнена в одной пробирке. Хотя метод «одной остановки» более удобен для быстрого обнаружения, он подвержен деградации образца во время повторного тестирования.
Проблемы и будущие направления RT-PCR
Хотя технология RT-PCR имеет множество преимуществ, она все же сталкивается с некоторыми проблемами. Например, в нескольких циклах ПЦР экспоненциальный рост комплементарной ДНК (кДНК) после обратной транскрипции приводит к неточной количественной оценке конечной точки, в то время как qRT-PCR преодолевает эту проблему благодаря добавлению технологии флуоресцентного мониторинга. Кроме того, высокая чувствительность означает, что даже следовые количества загрязнения ДНК могут исказить результаты. Поэтому крайне важно планировать и проектировать источники изменений в технологии.
Например, добавление известного количества РНК в качестве эталонного образца может помочь исследователям выполнить количественный контроль и анализ.
Благодаря постоянному развитию технологий RT-PCR имеет широкий потенциал применения в генетической диагностике, выявлении рака и раннем скрининге заболеваний. Ожидается, что в будущих научных исследованиях эта технология будет играть более важную роль в понимании изменений в экспрессии генов и механизмов, стоящих за ними.
Как благодаря углубленным исследованиям технологии RT-PCR применение этой технологии в генетической биологии изменит наше понимание жизненных процессов?
