Language
Country/Area
No result found
iải mã bí ẩn giữa quá trình lắp ráp bộ gen và phiên mã và tìm hiểu lý do tại sao đôi khi lắp ráp phiên mã lại là lựa chọn tốt nhất
Với sự phát triển của các công nghệ giải trình tự mới, chi phí giải trình tự đã giảm đáng kể từ năm 2008 đến năm 2012, khiến việc lắp ráp phiên mã trở thành lựa chọn lý tưởng cho nghiên cứu. Trước đây, chi phí giải trình tự bộ gen đã ngăn cản nhiều sinh vật không phải mô hình nhận được sự quan tâm đầy đủ, nhưng tất cả đã thay đổi với sự ra đời của công nghệ giải trình tự thông lượng cao (tức là công nghệ giải trình tự thế hệ tiếp theo). Sự phát triển của các công nghệ này không chỉ giúp giảm chi phí mà còn cải thiện hiệu quả công việc, cho phép mở rộng đối tượng nghiên cứu sang nhiều loại sinh vật không phải mô hình hơn. Ví dụ, bản sao mã não của đậu gà, giun dẹp, cua xanh Hawaii, cá sấu sông Nile, rắn ngô, rồng có râu và rùa tai đỏ đã được tập hợp và phân tích.
Việc kiểm tra các sinh vật không phải là mô hình có thể cung cấp những hiểu biết mới về cơ chế của "những cải tiến hình thái hấp dẫn" cho phép sự sống trên Trái đất phát triển.
Trong giới thực vật và động vật, nhiều "sáng kiến" như bắt chước, cộng sinh, ký sinh và sinh sản vô tính không thể được thử nghiệm trên các sinh vật mô hình thông thường. Vì các bản sao phiên mã thường rẻ hơn và đơn giản hơn bộ gen nên phương pháp này thường là lựa chọn tốt nhất để nghiên cứu các sinh vật không phải mô hình. Bản sao mã của những sinh vật này có thể tiết lộ những protein mới và các dạng biến thể của chúng liên quan đến những hiện tượng sinh học độc đáo này.
So sánh các bản sao và các bản sao bộ genMột bộ bản sao được lắp ráp là cần thiết cho các nghiên cứu biểu hiện gen ban đầu. Trước khi phát triển các chương trình tính toán để lắp ráp phiên mã, dữ liệu phiên mã chủ yếu được phân tích bằng cách lập bản đồ với bộ gen tham chiếu. Mặc dù phương pháp căn chỉnh bộ gen là một phương pháp mạnh mẽ để mô tả các trình tự phiên mã, nhưng nó có hạn chế là không thể giải thích được những thay đổi về cấu trúc trong bản phiên mã mRNA, chẳng hạn như quá trình ghép nối thay thế. Vì bộ gen chứa tất cả các intron và exon có thể xuất hiện trong bản phiên mã nên các biến thể ghép nối có sự sắp xếp không liên tục có thể bị bỏ qua như các biến thể protein thực tế. Ngay cả khi có sẵn bộ gen tham chiếu, vẫn nên thực hiện lắp ráp de novo vì nó cho phép phục hồi bản sao từ các đoạn bị thiếu trong bộ gen chính.
Sự khác biệt giữa bản sao mã và bộ gen
Không giống như mức độ bao phủ trình tự bộ gen, thay đổi ngẫu nhiên theo nội dung lặp lại trong DNA không mã hóa, mức độ bao phủ trình tự phiên mã có thể phản ánh trực tiếp mức độ biểu hiện gen. Những trình tự lặp lại này cũng tạo ra sự mơ hồ trong các cụm bộ gen, trong khi sự mơ hồ trong các cụm phiên mã thường tương ứng với các biến thể ghép nối hoặc những thay đổi nhỏ giữa các thành viên của họ gen. Có một số lý do tại sao trình lắp ráp bộ gen không thể được sử dụng trực tiếp để lắp ráp phiên mã. Đầu tiên, độ sâu của trình tự bộ gen thường nhất quán trên toàn bộ bộ gen, nhưng độ sâu của bản phiên mã có thể khác nhau. Thứ hai, cả hai chuỗi trong giải trình tự bộ gen luôn được giải trình tự, trong khi RNA-seq có thể là chuỗi cụ thể. Cuối cùng, việc lắp ráp bản sao trở nên khó khăn hơn vì các biến thể bản sao từ cùng một gen có thể chia sẻ các exon và khó phân tích rõ ràng.Phương pháp
RNA-seqSau khi RNA được chiết xuất và tinh chế từ tế bào, nó được gửi đến cơ sở giải trình tự thông lượng cao, tại đó RNA đầu tiên được phiên mã ngược để tạo ra thư viện cDNA. Các cDNA này sau đó có thể được phân mảnh thành nhiều độ dài khác nhau tùy thuộc vào nền tảng giải trình tự được sử dụng. Các nền tảng khác nhau sau đây sử dụng nhiều loại công nghệ khác nhau để giải trình tự hàng triệu đoạn đọc ngắn, bao gồm giải trình tự 454, Illumina và SOLiD.
Thuật toán lắp ráp
Các trình tự cDNA được tạo ra ở trên sẽ được lắp ráp thành bản sao thông qua chương trình lắp ráp bản sao đọc ngắn. Thông thường, có thể phát hiện một số biến thể axit amin, có thể phản ánh các biến thể protein khác nhau hoặc có thể đại diện cho các gen khác nhau trong cùng một họ gen hoặc thậm chí các gen chỉ chia sẻ miền bảo tồn. Mặc dù các chương trình này thường thành công trong việc lắp ráp bộ gen, nhưng chúng lại gặp phải những thách thức riêng trong việc lắp ráp phiên mã. Không giống như độ bao phủ trình tự cao đối với bộ gen, đối với bản phiên mã, độ bao phủ trình tự cao có thể ngụ ý trình tự phong phú thay vì trình tự lặp lại. Ngoài ra, giải trình tự phiên mã có thể mang tính đặc hiệu theo từng chuỗi, trong trường hợp đó cả phiên mã có nghĩa và ngược nghĩa đều có mặt. Cuối cùng, việc tái tạo và phân tích tất cả các biến thể ghép nối có thể trở nên khó khăn.
Ghi chú chức năng
Chú thích chức năng của bản sao đã lắp ráp cung cấp thông tin chi tiết về chức năng phân tử cụ thể của các protein, thành phần tế bào và quá trình sinh học. Blast2GO (B2G) có thể chú thích dữ liệu trình tự chưa có chú thích GO bằng cách căn chỉnh các đoạn contig đã lắp ráp với cơ sở dữ liệu protein không trùng lặp của NCBI. Đây là một công cụ thường được sử dụng trong các nghiên cứu bộ gen chức năng của các loài không phải là mô hình.
Xác thực và kiểm soát chất lượng
Vì bộ gen tham chiếu tốt hiếm khi có sẵn nên chất lượng của các cụm tính toán có thể được xác thực bằng cách so sánh các trình tự đã lắp ráp với các đoạn đọc được sử dụng để tạo ra chúng (không có tham chiếu) hoặc bằng cách sắp xếp các trình tự miền gen được bảo tồn với bản phiên mã hoặc bộ gen của một loài có quan hệ họ hàng gần (dựa trên tham chiếu). Các công cụ như Transrate và DETONATE thực hiện phân tích thống kê thông qua các phương pháp này để đánh giá chất lượng lắp ráp.
Trong lĩnh vực nghiên cứu bộ gen đang phát triển nhanh chóng này, việc lắp ráp bản sao mã chắc chắn là một trong những công cụ cốt lõi để hiểu được sự đa dạng của sự sống. Với sự đa dạng sinh học phong phú như vậy, làm thế nào chúng ta có thể áp dụng những phát hiện này vào các nỗ lực bảo tồn và công nghệ sinh học trong tương lai?
