Language
Country/Area
No result found
Bí mật của phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược: Làm thế nào để phát hiện biểu hiện gen thông qua RNA?
Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) là một kỹ thuật trong phòng thí nghiệm kết hợp quá trình phiên mã RNA thành DNA (trong bối cảnh này được gọi là DNA bổ sung hoặc cDNA) và khuếch đại một mục tiêu DNA cụ thể. Quá trình này sử dụng chuỗi polymerase phản ứng (PCR). Kỹ thuật này chủ yếu được sử dụng để đo lượng RNA cụ thể bằng cách theo dõi huỳnh quang của phản ứng khuếch đại, được gọi là PCR thời gian thực hoặc PCR định lượng (qPCR). Trong các tài liệu khoa học, một số tác giả đôi khi sử dụng RT-PCR một cách gây nhầm lẫn để chỉ PCR thời gian thực. Trong bài viết này, chúng tôi gọi RT-PCR là PCR phiên mã ngược.
Do tính đơn giản, độ đặc hiệu và độ nhạy cao, RT-PCR đã được sử dụng trong nhiều loại thí nghiệm khác nhau, từ định lượng tế bào nấm men trong rượu vang đến phát hiện mầm bệnh truyền nhiễm.
Nguyên lý và ứng dụng của RT-PCR
Nguyên lý của RT-PCR là đầu tiên chuyển đổi khuôn mẫu RNA thành cDNA, sau đó khuếch đại theo cấp số nhân bằng PCR. Sự thay đổi mang tính cách mạng trong quy trình này cho phép chúng ta phát hiện bản sao của hầu hết các gen và khuếch đại mẫu, loại bỏ lượng lớn vật liệu ban đầu cần thiết khi sử dụng phương pháp Northern blotting.
RT-PCR đã trở thành một trong những kỹ thuật quan trọng nhất từ phân tích biểu hiện gen đến chẩn đoán tác nhân gây bệnh truyền nhiễm. Ví dụ, các nhà khoa học đang nghiên cứu cách sử dụng RT-PCR để xét nghiệm ung thư nhằm cải thiện tiên lượng và theo dõi phản ứng điều trị.
Ví dụ, các tế bào khối u lưu thông tạo ra các bản sao mRNA độc đáo tùy thuộc vào loại ung thư và RT-PCR có thể phân tích mức độ biểu hiện của các bản sao này.
Sự tiến hóa về mặt kỹ thuật của RT-PCR
Kể từ lần đầu tiên giới thiệu phương pháp Northern blotting vào năm 1977, mặc dù kỹ thuật này có những nhược điểm trong việc định lượng RNA, chẳng hạn như tốn thời gian và cần lượng lớn RNA, RT-PCR đã trở thành phương pháp phổ biến để phát hiện và định lượng RNA kể từ khi phát minh ra PCR của Kary Mullis năm 1983. Phương pháp lựa chọn để định lượng. Quá trình này không những không cần xử lý sau mà còn có thể đo độ phong phú của RNA hơn 107 lần, từ đó cung cấp thêm dữ liệu về chất lượng và số lượng.Hiện nay, công nghệ RT-PCR đã phát triển nhiều chế độ hoạt động khác nhau: một cửa và hai bước. RT-PCR hai bước yêu cầu phải thực hiện phiên mã ngược và khuếch đại PCR trong các ống nghiệm khác nhau, trong khi RT-PCR một cửa có thể được thực hiện trong một ống nghiệm. Mặc dù phương pháp một cửa thuận tiện hơn cho việc phát hiện nhanh, nhưng nó dễ bị suy giảm mẫu khi thực hiện thử nghiệm nhiều lần.
Những thách thức và hướng đi tương lai của RT-PCR
Mặc dù công nghệ RT-PCR có nhiều ưu điểm nhưng vẫn còn một số thách thức. Ví dụ, trong nhiều chu kỳ PCR, sự tăng trưởng theo cấp số nhân của DNA bổ sung (cDNA) sau phiên mã ngược tạo ra kết quả định lượng điểm cuối không chính xác, trong khi qRT-PCR khắc phục được vấn đề này nhờ bổ sung công nghệ giám sát huỳnh quang. Ngoài ra, độ nhạy cao có nghĩa là ngay cả lượng nhỏ DNA bị nhiễm bẩn cũng có thể làm sai lệch kết quả. Do đó, việc lập kế hoạch và thiết kế để ứng phó với những biến động trong công nghệ là rất quan trọng.
Ví dụ, việc thêm một lượng RNA đã biết làm mẫu tham chiếu có thể giúp các nhà nghiên cứu thực hiện kiểm soát và phân tích định lượng.
Với sự phát triển không ngừng của công nghệ, RT-PCR có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán di truyền, phát hiện ung thư và sàng lọc sớm bệnh tật. Có thể thấy trước rằng trong nghiên cứu khoa học trong tương lai, công nghệ này sẽ đóng vai trò quan trọng hơn trong việc hiểu những thay đổi trong biểu hiện gen và cơ chế đằng sau chúng.
Với nghiên cứu sâu rộng về công nghệ RT-PCR, ứng dụng công nghệ này trong sinh học di truyền sẽ thay đổi hiểu biết của chúng ta về các quá trình sống như thế nào?
