Language
Country/Area
No result found
Sanger测序的过去与NGS的未来：DNA测序如何从单一到并行？
在生物医学领域，DNA测序技术经历了重大的变革。自从Sanger测序的提出以来，为我们揭开了基因组的奥秘，而下一代测序（NGS）的出现则将这项技术推向了全新的高度。这种从单一到并行的技术跨越，不仅提高了测序的速度，也降低了测序的成本，从而改变了基因组学的研究面貌。
NGS的出现，让我们能够在短时间内获得数以千万计的基因组数据，这是Sanger测序无法比拟的。
NGS是指各种高通量的DNA测序方法，这些方法利用了大规模并行处理的概念。自1993年至1998年间，许多这类技术相继出现，并于2005年完成商业化。这些技术允许每个仪器运行时产生从1百万到43十亿个短序列读取。在这些平台中，技术配置和测序化学各有不同，但它们共享着一个共同的技术范式：通过空间上分离的、克隆增幅的DNA模板或单个DNA分子进行大规模并行测序。
与此同时，Sanger测序又称为第一代测序，依赖电泳分离的末端产物。这种方法虽然历史悠久，但在面对现今的科学需求时显得力不从心。NGS的方法论让我们得以一次性完成大规模的测序工作，为基因研究带来了前所未有的效率和精确性。
NGS平台
使用商业可用的NGS平台进行DNA测序的过程通常分为几个步骤：
- 通过体外PCR克隆扩增产生DNA测序文库。
- 通过合成测序，根据互补链上核苷酸的增加来确定DNA序列。
- 空间上分离的、被扩增的DNA模板以大规模平行的方式同时进行测序，无需物理分离步骤。
这些步骤虽然在大多数NGS平台上相似，但每个平台的策略各不相同，这使得每个技术在市场上都有其独特性和应用领域。
NGS的平行化测序反应能够在一次仪器运行中生成数百兆到千兆的核苷酸序列读取。这一变革大大提高了可用序列数据的量，使得医学科学的基因组测序方法发生了根本性的变化。随着新兴的NGS技术和仪器的出现，测序的成本也显著降低，接近每个基因组仅需1000美元的标准。
模板准备方法
进行NGS反应时，主要有两种方法用于准备模板：来自单个DNA分子的增幅模板和单个DNA分子模板。
对于无法检测单一萤光事件的成像系统，则需要对DNA模板进行扩增。常用的扩增方法有乳液PCR、滚环扩增和固相扩增等。
乳液PCR
在乳液PCR方法中，首先通过随机碎片化基因组DNA产生DNA文库，然后将单链DNA片段连接到带有接头的颗粒表面，袜开后每颗粒皆代表一个DNA片段。这些颗粒随后被包装到水油乳液微滴中，每个微滴都是一个PCR微反应器，在这里产生增幅的单一DNA模板复本。
桥接扩增
在桥接扩增中，正反引物以高密度共价附着于流动胞的基底上。经过酶促延伸的试剂暴露后，配对模板在表面引物上延伸，最终完成在数百万个不同位置的DNA聚合物的本地增幅，成为一个独立的模板丛集。
单分子模板
单分子模板的准备相比之下更为直观，这不需要PCR步骤。一般来说，单分子模板会被固定在固体支撑上，并用不同的方式进行扩增。如在第一种方式中，将空间上分布的引物固定在固体支撑上，然后将已随机切割的DNA片段与固定的引物杂交。
测序方法
NGS的测序方法各有特点，其中包括合成测序、焦磷酸测序和可逆终止子化学法等。合成测序的目的是通过检测DNA聚合酶的核苷酸加入来确定样本的序列。
可以说，失去了传统Sanger测序所需的繁琐步骤后，NGS提供了一个更高效的基因组研究范式。
随着技术的发展，我们见证了DNA测序从早期的单一序列方法转变为如今的并行处理模式，这不仅极大地提高了效率，更在成本和时间上带来了前所未有的优势。未来的DNA测序技术将会朝哪个方向发展？
