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從膳食到科學：你知道酶如何切割蛋白質成為小片段嗎？
在生物學中，蛋白質是生命活動的重要角色，而對蛋白質的分析能夠揭示其功能及結構。一種被廣泛使用的分析技巧稱為肽質量指紋（Peptide Mass Fingerprinting, PMF），這種技術能夠幫助研究者識別未知蛋白質的特性。在PMF中，目標蛋白質會首先被切割成較小的肽段，接著這些肽的品質可以用像MALDI-TOF和ESI-TOF等質譜儀精確測量。
肽質量指紋技術的出現，顯著簡化了蛋白質識別的過程，使得科學家能夠在較短的時間內分析複雜的蛋白質樣本。
PMF方法於1993年被幾個研究團隊獨立開發，這一方法的核心是將未知蛋白質的質量與已知蛋白質的質量進行比較。這一過程需要使用計算機程序，這些程序可以將所研究生物的基因組轉譯為蛋白質，然後理論上將其切割為肽段，並計算出每個肽段的質量。接著，他們將未知蛋白質的肽段質量與基因組編碼的每個蛋白質的理論肽質量進行比較，最終透過統計分析找出最佳匹配。
肽質量指紋技術的起源
由於分析蛋白質的過程繁瑣，肽質量指紋技術應運而生。在這之前，Edman降解法被用於蛋白質分析，但分析一個氨基酸殘基需時近一小時。另外，SDS-PAGE技術用來分離複雜混合物中的蛋白質，過程中還涉及電轉印和染色等步驟。然而，這樣的過程中經常出現的問題是干擾蛋白質與目標蛋白質一起純化，這使得分析更加困難。因此，對已知的蛋白質污染物的序列進行編碼並將其納入所謂的Dayhoff資料庫，能夠減少儀器的分析時間和費用。
樣品準備過程
在進行肽質量指紋分析之前，蛋白質樣品通常來自SDS-PAGE或反相HPLC，並需要經過一些化學修飾。蛋白質中的二硫鍵會被還原，半胱氨酸氨基酸則會經過化學方法進行羧基甲基化或丙烯酰化。接著，使用諸如胰蛋白酶、洛伐他汀或Glu-C等蛋白酶將蛋白質切割為多個片段。一般而言，樣品與酶的比例為50:1。蛋白質的水解一般需要過夜，隨後利用乙腈萃取出產生的肽，並在真空下乾燥。這些肽隨後會溶解於少量的蒸餾水中，或進一步濃縮和純化，準備進行質譜分析。
質譜分析
消化後的蛋白質可以通過不同類型的質譜儀進行分析，如ESI-TOF或MALDI-TOF。MALDI-TOF通常是首選儀器，因為它能夠實現高樣品通量，在單次實驗中分析多個蛋白質。如果結合使用MS/MS分析，則其效果尤為顯著。在進行MALDI-TOF分析時，通常將少量的肽（通常不超過1微升）置於MALDI目標上，並加入一種被稱為基質的化學物質。常用的基質包括肉桂酸、α-氰基-4-羥基肉桂酸和2,3-二羥基苯甲酸等。這些基質分子有助於肽分子的脫附。
基質和肽分子在MALDI目標上共同結晶，然後準備進入質譜分析。MALDI-MS的取樣技術主要是乾燥水滴技術。質譜儀會插入真空腔中，並由脈衝激光的火光觸發聚合物片段的脫附和電離。通過這一過程，質量和電荷的比例可根據它們在漂移管中的飛行時間進行計算。
計算分析過程
質譜分析後會產生一份質量清單，通常稱為峰清單。這些肽的質量將與包含蛋白質序列信息的數據庫進行比較，如Swissprot等。計算機軟件會對數據庫中的蛋白質進行「在計算上消化」，以便與在化學裂解反應中使用的相同酶（如胰蛋白酶）進行比較。這些肽的質量會被計算出來並與測量到的質量峰清單進行比較。結果進行統計分析後，可能的匹配將返回結果表。
未來的方向
肽質量指紋技術代表了生物學和化學分析中一個重要的進步。然而，隨著技術的進步，對於樣品的要求與數據庫的更新仍然是未來研究的重要方向。多元組合的樣本和新型質譜儀的出現，將不斷挑戰和擴展這一技術的邊界。在探索這些技術的進步過程中，我們是否能找到更有效、更準確的方式來識別和分析蛋白質呢？
