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Von der Gewebefixierung bis zur Färbung: Kennen Sie den mysteriösen Prozess der Immunhistochemie?
Bei der Immunhistochemie handelt es sich um eine Immunfärbetechnik, bei der es um die selektive Erkennung von Antigenen (Proteinen) in Zellen und Geweben durch Antikörper geht. Diese Technik entwickelte sich aus der Immunfluoreszenztechnik, die ursprünglich 1941 von Albert Hewitt Coons und anderen entwickelt wurde. Im Laufe der Zeit hat sich die Immunhistochemie in der Krebsdiagnose und der Grundlagenforschung als gängige Methode etabliert und hilft Wissenschaftlern, die Verteilung von Biomarkern und unterschiedlich exprimierten Proteinen in verschiedenen biologischen Geweben zu untersuchen.
Probenvorbereitung
Die Immunhistochemie kann an fixierten und in Paraffin eingebetteten Geweben oder an gefrorenen Geweben durchgeführt werden. Vor der Probenentnahme sind je nach Konservierung des Gewebes verschiedene Schritte notwendig. Die allgemeinen Schritte umfassen: entsprechende Fixierung, Antigen-Retrieval, Inkubation mit Primärantikörpern und anschließende Inkubation mit Sekundärantikörpern.
Gewebepräparation und -fixierung
Die Fixierung von Gewebe ist für die Aufrechterhaltung der Gewebestruktur und Zellform von entscheidender Bedeutung. Die Zusammensetzung des Fixiermittels, das Verhältnis von Fixiermittel zu Gewebe und die Fixierzeit beeinflussen das Endergebnis erheblich. Als Fixiermittel wird üblicherweise 10 % neutral gepuffertes Formalin verwendet und die Fixierzeit beträgt bei Raumtemperatur üblicherweise 24 Stunden.
Scheibe
Gewebeproben wurden mit einem Mikrotom geschnitten. Bei paraffineingebettetem Gewebe ist eine Dicke von 4 Mikrometern ein gängiger Standard, während Gefrierschnitte typischerweise 4 bis 6 Mikrometer dick sind. Die Dicke der Schnitte ist entscheidend und unterschiedliche Dicken können die Visualisierung der Antigene beeinträchtigen. Daher ist bei der Durchführung einer Immunhistochemie äußerste Vorsicht geboten.
Antigen-Rückgewinnung
In fixierten Gewebeschnitten werden durch die Antigen-Retrieval-Technik antigene Stellen für Antikörper sichtbar. Während der Fixierung können sich Methanbrücken oder Querverbindungen von Aminogruppen bilden, die die Antikörperbindung behindern. Die gebräuchlichste Methode zur Antigengewinnung besteht in der Wiederherstellung der latenten Antigenität durch Erhitzen und Einweichen in einer Pufferlösung.
Tag-Beispiel
Die Markierung von Proben kann durch die Verwendung von Antikörpern erfolgen, die mit fluoreszierenden Verbindungen, Metallen oder Enzymen markiert sind, um Zielantigene effektiv zu unterscheiden.
Erkennungsmethoden
Bei der direkten Methode handelt es sich um eine einstufige Färbemethode, während bei der indirekten Methode zunächst ein unmarkierter Primärantikörper an das Zielantigen bindet und anschließend ein Sekundärantikörper hinzugefügt wird, der an den Primärantikörper bindet. Aufgrund des Signalverstärkungseffekts der indirekten Methode weist sie eine höhere Empfindlichkeit auf und wird häufig zum Nachweis mehrerer Antigene verwendet.
Nachweisreportermoleküle
Die erkannten Reportermoleküle variieren je nach Nachweismethode. Am häufigsten werden Chromogen- und Fluoreszenznachweise verwendet. Bei der chromogenen Immunhistochemie werden Antikörper üblicherweise an ein Enzym konjugiert und erzeugen in Gegenwart eines chromogenen Substrats eine sichtbare Farbe. Bei der Immunfluoreszenzdetektion wird der Antikörper mit einem Fluorophor markiert.
Anwendung in der klinischen Praxis
Immunhistochemische Techniken spielen in der diagnostischen chirurgischen Pathologie eine große Rolle, insbesondere bei der Immunphänotypisierung von Tumoren (z. B. zur Identifizierung von Markern für Brustkrebs). Das Anwendungsspektrum ist vielfältig und reicht von der Neurowissenschaft bis zur Tumordiagnostik. Forscher können damit das Verhalten von Proteinen in bestimmten Geweben erforschen.
Die Herausforderung annehmen
In der Immunhistochemie gibt es mehrere Schritte, die zu unterschiedlichen Problemen führen können, wie beispielsweise einer übermäßigen Hintergrundfärbung oder einer unzureichenden Antigenmarkierung.
Um diese Probleme zu lösen, müssen Forscher die Qualität und Technologie der Antikörper optimieren.
AbschlussDie Immunhistochemie ist nicht nur eine effektive Nachweistechnik, sie ermöglicht uns auch, die Verteilung von Proteinen in biologischen Geweben zu entdecken und zu verstehen. Mit dem technologischen Fortschritt wird sich ihre Anwendung in Klinik und Forschung weiter ausweiten. Sind Sie bereit, die neuen Horizonte zu erkunden, die diese Technologie eröffnen kann?
