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Die wunderbare Kombination von Antikörper und Antigen: Wie funktioniert Immunhistochemie?
Immunhistochemie (IHC) ist eine Technik, die auf der Bindung von Antikörpern an spezifische Antigene beruht, wodurch das Vorhandensein von Antigenen in Zellen und Geweben bestätigt werden kann. Diese Methode geht auf die Immunfluoreszenz-Technologie zurück, die 1941 von Wissenschaftlern wie Albert Hewett Coons entwickelt wurde und den Grundstein für die spätere Immunhistochemie legte. Im Laufe der Zeit wurde die Immunhistochemie häufig in der Krebsdiagnose eingesetzt, insbesondere bei der Identifizierung von Tumorantigenen. Daher ist das Verständnis der Verfahren der Immunhistochemie für die medizinische und biologische Forschung von entscheidender Bedeutung.
Heutzutage gilt die Immunhistochemie als leistungsstarkes Instrument zur Erforschung von Biomarkern. Mit dieser Technologie können Forscher die Expression und Lokalisierung verschiedener Proteine in biologischen Geweben bestimmen.
Probenvorbereitung
Für die Immunhistochemie werden Gewebeproben verwendet, die in Paraffin fixiert und eingebettet sind. Manchmal wird auch kryokonserviertes (gefrorenes) Gewebe verwendet. Der Probenvorbereitungsprozess umfasst die Fixierung, die Antigengewinnung, die Inkubation mit primären Antikörpern und schließlich die Inkubation mit sekundären Antikörpern. Während dieses Prozesses ist jeder Schritt entscheidend für das Endergebnis.
Gewebevorbereitung und -fixierung
Vor der Durchführung der Immunhistochemie wird das Gewebe fixiert, um die morphologische Struktur des Gewebes zu erhalten. Das zur Fixierung verwendete Reagenz ist normalerweise 10 % neutrales gepuffertes Formalin. Die Fixierungszeit und das Reagenzverhältnis haben einen erheblichen Einfluss auf die experimentellen Ergebnisse. Im Allgemeinen beträgt die Fixierungszeit 24 Stunden und das Verhältnis von Fixiermittel zu Gewebe liegt zwischen 1:1 und 1:20.
Scheiben
Das Schneiden der Proben erfolgte mit einem Mikrotom. In Paraffin eingebettetes Gewebe wird typischerweise mit einer Dicke von 4 Mikrometern geschnitten, während Kryoschnitte mit einer Dicke von 4 bis 6 Mikrometern geschnitten werden. Die Dicke der Schnitte ist ein entscheidender Faktor für den Erfolg der Immunhistochemie, da Unterschiede in der Dicke die beobachtete Antigenpräsentation beeinflussen können.
Antigen-Abruf
Für die meisten fixierten Gewebeschnitte ist eine Antigengewinnung erforderlich. Sein Zweck besteht darin, die bei der Fixierung gebildeten Querverbindungen wiederherzustellen, um das Epitop für den Antikörper zugänglich zu machen. Eine übliche Methode zur Antigengewinnung besteht darin, Schnitte durch Erhitzen auf hohe Temperaturen in Puffer einzutauchen.
Der Erfolg der Antigengewinnung bestimmt oft die Sensitivität und Spezifität immunhistochemischer Tests.
Blockieren
In der Immunhistochemie kann die unspezifische Bindung von Antikörpern zu Problemen mit der Hintergrundfärbung führen. Um die Hintergrundfärbung zu reduzieren, werden Proben häufig mit normalem Serum der Spezies inkubiert, aus der der sekundäre Antikörper hergestellt wurde.
Beispiel-Tag
Nachdem die Probenvorbereitung abgeschlossen ist, kann sie mit Antikörpern markiert werden, die mit fluoreszierenden Verbindungen, Metallen oder Enzymen markiert sind. Je nach gewünschter Anwendung können Antikörper polyklonal oder monoklonal sein.
Erkennungsmethode
In der Immunhistochemie gibt es zwei Hauptnachweismethoden: die direkte Methode und die indirekte Methode. Bei der direkten Methode werden markierte Antikörper verwendet, um direkt mit den Antigenen in den Schnitten zu reagieren, während bei der indirekten Methode die Empfindlichkeit verbessert und der Signalverstärkungseffekt durch die Kombination sekundärer Antikörper erhöht wird.
Der Vorteil der indirekten Methode besteht darin, dass sie die Erzeugung einer relativ kleinen Anzahl markierter Sekundärantikörper erfordert, was bei Mehrfachmarkierung sehr nützlich ist.
Reporter
Die in den verschiedenen Nachweismethoden verwendeten Reportermoleküle sind unterschiedlich. Die häufigsten sind die Chromogen- und Fluoreszenzdetektion. In der chromogenen Immunhistochemie werden Antikörper mit Enzymen kombiniert und reagieren mit Substraten, um eine sichtbare Farbe zu erzeugen. Bei der Fluoreszenzdetektion werden fluoreszierende Pigmente verwendet, um den Antikörper zum Leuchten zu bringen und so eine einfache Beobachtung zu ermöglichen.
Färbung mit umgekehrter Zählung
Nachdem die immunhistochemische Färbung abgeschlossen ist, wird häufig eine Rückwärtszählungsfärbung angewendet, um Kontrast zu schaffen und die Führung und Visualisierung des Gewebes zu erleichtern.
In vielen Fällen kann die umgekehrte Zählfärbung die Beobachtungsfähigkeiten des Forschers erheblich verbessern.
Fehlerbehebung
Bei der Anwendung der Immunhistochemie können Probleme wie übermäßige Hintergrundfärbung, schwache Zielantigenfärbung und Artefakte auftreten, die sich auf die Testergebnisse auswirken. Daher sollten immunhistochemische Techniken optimiert und die Qualität der Antikörper sichergestellt werden.
Immunhistochemische Marker in der klinischen Diagnose
Diese Technologie ist zu einem wichtigen Werkzeug in der neurowissenschaftlichen Forschung geworden, nicht nur zur Bestätigung der Proteinexpression, sondern auch zur Tumoridentifizierung. Beispielsweise werden CD15- und CD30-Marker für die Hodgkin-Krankheit verwendet, während PSA für die Prostatakrebsdiagnose verwendet wird.
Geführte Therapie
Mit fortschreitender Krebsbehandlung kann die Immunhistochemie eingesetzt werden, um zu beurteilen, welche Tumoren wahrscheinlich auf die Behandlung ansprechen, indem das Vorhandensein molekularer Ziele nachgewiesen wird. Hormonrezeptoren in bestimmten Tumoren können durch immunhistochemische Signale bestätigt werden, was die Umsetzung einer personalisierten Therapie erleichtern kann.
Daher ist die Immunhistochemie nicht nur ein diagnostisches Instrument, sondern auch eine Schlüsselkomponente im klinischen Behandlungsprozess.
Zusammenfassend stellt uns die Immunhistochemie ein leistungsstarkes Werkzeug zur Identifizierung und Lokalisierung von Biomarkern auf Zell- und Gewebeebene zur Verfügung. Doch wie können wir diese Technologie weiter optimieren, um der medizinischen und forschenden Gemeinschaft in Zukunft einen besseren Service zu bieten?
