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esde 1984 hasta hoy: ¿Cómo se convirtió el ensayo del cometa en el estándar de oro para evaluar el daño genético
El ensayo cometa implica suspender células en agarosa de bajo punto de fusión, luego lisar las células en condiciones neutras o alcalinas y someter las células lisadas suspendidas a electroforesis. El método recibe su nombre del patrón de cometa que forma el ADN al pasar a través de un gel electroforético.
Proceso básico del experimento del cometa
1. Pasos para la incrustaciónLas muestras de células tomadas de cultivos celulares in vitro o de sujetos de prueba in vivo se dispersan en células individuales y se suspenden en agarosa de bajo punto de fusión fundida a 37 °C. Esta única suspensión se extendió luego sobre portaobjetos de microscopio y se montó utilizando cubreobjetos de vidrio. A medida que se baja el cubreobjetos sobre el portaobjetos del microscopio, la agarosa fundida se extiende para formar una capa fina. Luego, la agarosa se congeló a 4°C y se retiró el cubreobjetos, formándose una matriz de fibra de carbohidratos que encapsuló las células.
2. Etapa de lisis
Después de retirar el cubreobjetos, el portaobjetos del microscopio se sumerge en una solución que lisa las células. Las soluciones de lisis comúnmente utilizadas incluyen solución salina altamente concentrada y un detergente como Triton X-100. La función de estos componentes es destruir las proteínas celulares y las membranas celulares, exponer la estructura del ADN y formar nucleosomas con ADN helicoidal.
3. Etapa de electroforesis
Después de la lisis, los portaobjetos se lavan para eliminar cualquier sal y luego se sumergen en una segunda solución: la solución de electroforesis. Cuando se aplica un campo eléctrico, los fragmentos de ADN cargados negativamente se mueven hacia el electrodo positivo hasta que se purifican y se marcan con una tinción específica. Observada mediante microscopía de fluorescencia, la diferencia de intensidad de la cola del cometa con respecto a su cabeza refleja el número de roturas de ADN.
La estructura general se asemeja a un cometa, con su cabeza redonda correspondiente al ADN no dañado que queda en la cavidad y la cola representando la cantidad de ADN dañado. Cuanto más brillante y larga sea la cola, mayor será el grado de daño.
Aplicaciones del ensayo del cometa
El ensayo cometa tiene una amplia gama de aplicaciones, incluidas pruebas de genotoxicidad, biomonitoreo humano y estudios de bioepidemiología. Por ejemplo, a través del ensayo del cometa, los investigadores descubrieron que con la edad, el daño del ADN en las neuronas y los astrocitos del cerebro del ratón aumentaba significativamente, incluidas múltiples formas de daño como roturas de cadena simple y de cadena doble.Detección de fragmentación del ADN del esperma
El ensayo cometa también se puede utilizar para evaluar el grado de fragmentación del ADN en los espermatozoides, un indicador que está estrechamente relacionado con el resultado de la fertilización in vitro. Cuando se realiza la prueba, se realiza un procedimiento adicional para destruir los prototecios del espermatozoide.
Ventajas y desafíos del ensayo Comet La popularidad del ensayo cometa se ha visto aumentada por su simplicidad y bajo costo, particularmente en entornos donde no hay disponibles pruebas más complejas. Sin embargo, la sensibilidad de esta técnica también la hace susceptible a factores externos, lo que genera problemas con la reproducibilidad de los resultados. Por lo tanto, los investigadores deben ser cautelosos y evitar cualquier interferencia que pueda causar daño o desnaturalización del ADN."El ensayo del cometa es una herramienta muy sensible para evaluar el daño del ADN, pero su uso efectivo depende de amplios conocimientos y técnicas de fondo".
Futuras direcciones de investigación
A medida que avanza la biotecnología, es inevitable que la tecnología y las aplicaciones del ensayo cometa evolucionen con ella. Los investigadores están explorando cómo mejorar aún más la precisión y sensibilidad de la prueba y ampliar su aplicación en diferentes organismos y condiciones ambientales. Por lo tanto, el futuro del ensayo de cometas está lleno de desafíos y oportunidades.
El uso de esta tecnología en la evaluación del daño genético, la ciencia ambiental y la investigación médica sin duda seguirá creciendo, junto con una mayor comprensión de su uso adecuado y la interpretación de los resultados. Al mirar hacia el futuro, deberíamos pensar en cómo garantizar que esta importante tecnología pueda alcanzar su máximo potencial para mejorar la salud humana y proteger el medio ambiente.
