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El secreto del ensayo del cometa: ¿Cómo detectar daños en el ADN con una técnica sencilla?
Con el avance de la tecnología genética, el estudio del daño al ADN se ha vuelto cada vez más importante. En este campo, una técnica llamada prueba de electroforesis en gel de células individuales (también conocida como ensayo cometa) ha ganado gradualmente atención. Se trata de una técnica sencilla y sensible que puede detectar daños en el ADN a nivel de células eucariotas individuales. Esta técnica fue desarrollada por primera vez por Östling y Johansson en 1984 y mejorada por Singh et al. en 1988. Hasta la fecha, se ha convertido en una de las técnicas estándar para evaluar el daño/reparación del ADN y las pruebas de genotoxicidad.
El ensayo del cometa recibe su nombre del patrón de migración del ADN en un gel de electroforesis, que a menudo se asemeja a un cometa.
El procedimiento básico del ensayo cometa implica la inclusión de células en agarosa de bajo punto de fusión, seguido de lisis celular y electroforesis en condiciones neutras o alcalinas. Después de la electroforesis, el ADN dañado aparecerá en diferentes formas, y la intensidad relativa entre la cola y la cabeza del cometa refleja el grado de daño del ADN. La tecnología se basa en el hecho de que el ADN no dañado tiene una asociación altamente organizada con las proteínas de la matriz en el núcleo celular, y cuando el ADN se daña, esta organización se altera, liberando la estructura del ADN no dañado.
Pasos básicos del ensayo del cometa
Células incrustadas
En primer lugar, las muestras de células obtenidas de cultivos celulares in vitro o de sujetos de prueba in vivo se dispersan en células individuales y se suspenden en agarosa de bajo punto de fusión a 37 °C. Esta única suspensión se aplica luego a un portaobjetos de microscopio y cuando se baja un cubreobjetos de vidrio, la agarosa se extiende para formar una capa fina. Cuando la agarosa se congela a 4 °C, las células se fijan en su interior y la matriz de agarosa formada puede mantener las células en una posición estable.
Lisis celular
A continuación, los portaobjetos se sumergen en una solución de lisis, que normalmente contiene altas concentraciones de sales solubles en agua y detergentes. Estos ingredientes son capaces de dañar las proteínas dentro de las células y desgarrar las membranas celulares, dejando el ADN intacto. Las estructuras de ADN restantes se denominan nucleoides, que forman estructuras relativamente grandes y bien ordenadas.
Proceso de electroforesis
Después del proceso de lisis, los portaobjetos se lavan para eliminar todas las sales y se sumergen en la solución de electroforesis. En este momento, se aplica un campo eléctrico específico y el ADN dañado será atraído por el campo eléctrico. Dependiendo de la longitud del segmento de la cadena, la distancia de migración también será diferente, formándose finalmente una estructura de cola y cabeza similar a la de un cometa. .
Las técnicas de análisis de imágenes pueden cuantificar la intensidad de fluorescencia general del nucleido así como la fluorescencia del ADN migratorio, permitiendo así evaluar el grado de daño al ADN.
Ámbito de aplicación
El ensayo cometa tiene una amplia gama de aplicaciones, incluidas las pruebas de genotoxicidad, el biomonitoreo humano, la epidemiología molecular y la toxicología ecogenética. No sólo ayudará a los científicos a comprender los efectos de diferentes factores ambientales en el ADN, sino que también profundizará nuestra comprensión del proceso de envejecimiento al rastrear el daño del ADN durante el proceso de envejecimiento.
Por ejemplo, Swain y Rao informaron en su estudio que los ensayos con cometas mostraron un aumento significativo del daño al ADN en las neuronas cerebrales y los astrocitos de ratas viejas.
Aplicación en la infertilidad masculina
Además, la prueba del cometa también tiene un importante valor de aplicación en el diagnóstico de la infertilidad masculina. Esta tecnología de prueba puede ayudar a evaluar el grado de fragmentación del ADN de los espermatozoides y proporcionar una predicción del resultado probable durante la fertilización in vitro.
Desafíos experimentales
Aunque el ensayo cometa es un método muy sensible para detectar daños en el ADN, su sensibilidad también lo hace particularmente sensible a algunos cambios físicos y puede afectar la reproducibilidad de los resultados. Por lo tanto, al realizar la operación se debe tener especial cuidado para evitar cualquier factor interferente que pueda causar daños al ADN.
Como técnica simple y rentable, el ensayo cometa se utiliza a menudo en entornos de investigación con condiciones complejas y recursos financieros limitados. Con más investigaciones y la aparición de herramientas mejoradas, las perspectivas de aplicación de esta tecnología son prometedoras. ¿Podrá superar más obstáculos científicos en el futuro y descubrir nuevas formas de reparar el ADN?
