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La magia del ensayo del cometa: ¿Por qué el ADN se mueve como un cometa en la electroforesis?
En el mundo de la ciencia, detectar daños en el ADN nunca ha sido fácil. Sin embargo, el ensayo de electroforesis en gelatina de una sola célula (también conocido como ensayo cometa) proporciona un método simple y sensible para detectar daños en el ADN en células eucariotas individuales. Esta técnica fue desarrollada por primera vez por Östling y Johansson en 1984 y luego mejorada por Singh et al. en 1988. Desde entonces se ha convertido en una de las técnicas estándar para la reparación y el daño del ADN, el monitoreo ambiental y las pruebas de mutagenicidad.
El ensayo del cometa recibe su nombre del patrón de migración del ADN en un gel electroforético, que a menudo se asemeja a un cometa.
El protocolo básico para este ensayo implica encapsular las células en una suspensión de agarosa de bajo punto de fusión, luego lisar las células en condiciones neutras o alcalinas (pH > 13) y realizar una electroforesis de las células lisadas suspendidas. Durante este proceso, se examina la estructura del ADN de la célula, formando patrones únicos de "cometa" que reflejan el alcance del daño al ADN.
Cómo funciona
El principio básico del ensayo cometa es que el ADN no dañado conserva una asociación altamente ordenada con las proteínas de la matriz en el núcleo celular, y esta estructura se verá alterada cuando el ADN se dañe. Las cadenas de ADN dañadas pierden su estructura compacta y se relajan, comenzando a expandirse hacia la agarosa. Cuando se aplica un campo eléctrico, el ADN cargado negativamente es atraído hacia el ánodo cargado positivamente, creando así una forma de "cometa".
Cuanto mayor sea el grado de daño, más largas y brillantes serán las colas de ADN, ya que más fragmentos de ADN podrán liberarse de la célula a la agarosa.
Pasos del ensayo del cometa
Encapsulación celular
En primer lugar, los investigadores necesitan obtener células de cultivos celulares in vitro o de muestras in vivo, luego dispersar estas células en células individuales y suspenderlas en agarosa de bajo punto de fusión fundida a 37 °C. Esta suspensión unicelular se extiende luego sobre un portaobjetos de vidrio para microscopio y forma una fina capa de agarosa a medida que se enfría. La presión osmótica neutra de la agarosa permite que los reactivos penetren sin afectar la posición de las células.
Agrietamiento
A continuación, los portaobjetos se sumergen en una solución que provoca la lisis de las células. Esta solución generalmente contiene sal y detergente altamente concentrados. El agua salada puede destruir la estructura proteica dentro de las células y disolver la membrana celular. De esta manera, sólo el ADN permanece intacto y llena el espacio que anteriormente ocupaba la célula, formándose una estructura denominada cariotipo.
Electroforesis
Una vez lisadas las células, los portaobjetos se lavan para eliminar el exceso de sales y se sumergen en la solución de electroforesis. Durante la electroforesis, el campo eléctrico aplicado hace que el ADN dañado se desplace hacia el ánodo. De esta manera, el grado de daño afecta directamente el rango de migración del ADN y, por lo tanto, la forma del "cometa".
Esta tecnología tiene una sensibilidad extremadamente alta para el daño del ADN, lo que la convierte en una amplia herramienta de detección.
Áreas de aplicación
El ensayo cometa se utiliza comúnmente en los campos de pruebas de genotoxicidad, biomonitoreo humano, epidemiología molecular y toxicología ecogenética. Estudios recientes han demostrado que durante el envejecimiento se pueden detectar múltiples tipos de daños en el ADN, como roturas de cadena simple y de cadena doble, utilizando el ensayo cometa. En el diagnóstico de la infertilidad masculina, los investigadores también pueden utilizar el ensayo cometa para evaluar el grado de fragmentación del ADN en los espermatozoides.En general, el ensayo cometa proporciona una técnica eficaz y flexible para detectar daños en el ADN de las células, lo que puede desempeñar un papel único tanto en la investigación básica como en la ciencia aplicada. A medida que esta tecnología continúa avanzando, ¿habrá en el futuro formas más innovadoras de detectar y reparar daños en el ADN, permitiendo que la salud humana alcance nuevos hitos?
