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Los sorprendentes usos de la microscopía FLIM: ¿Cómo obtener imágenes de ultra alta resolución en detección en tiempo real?
A medida que la ciencia y la tecnología avanzan a un ritmo rápido, la tecnología de los microscopios también innova constantemente. Entre ellos, la microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) se ha convertido en una herramienta importante en la investigación en ciencias de la vida y de los materiales debido a su principio de imágenes único y sus aplicaciones prácticas. A diferencia de la microscopía tradicional, que utiliza la intensidad de fluorescencia como base para la obtención de imágenes, FLIM genera imágenes basadas en la velocidad a la que las moléculas fluorescentes regresan de un estado excitado a un estado fundamental, en lugar de en su intensidad.
Al medir la vida útil de la fluorescencia, FLIM no solo elimina los errores de medición causados por variaciones en el brillo de la fuente de luz, la intensidad de la luz de fondo o el fotoblanqueo, sino que también minimiza los efectos de la dispersión de fotones en capas de muestra gruesas.
"El cambio en el tiempo de vida de la fluorescencia depende del microambiente local de la molécula fluorescente y, por lo tanto, puede servir como indicador del pH, la viscosidad y la concentración química, entre otras cosas".
Principios básicos del tiempo de vida de la fluorescencia
Cuando son excitadas por fotones, las moléculas de fotones regresan al estado fundamental con diferentes probabilidades a través de la radiación electromagnética y vías de desintegración no radiactiva. Sólo la vía que implica la emisión espontánea de fotones conduce a la formación de fluorescencia. Según la ley de Schott, la expresión matemática de la descomposición de la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo puede simplificarse a una función exponencial. Esto demuestra que la vida útil de la fluorescencia es una cantidad física que es independiente de la intensidad inicial.
Tecnología de medición e implementación FLIM
En FLIM, el instrumento utiliza una fuente de excitación pulsada y luego registra la curva de decaimiento a través de la función de respuesta de la máquina. Cuando un grupo de moléculas fluorescentes es excitado por un pulso de luz ultracorto, la fluorescencia resuelta en el tiempo resultante inevitablemente exhibirá una descomposición exponencial. La implementación más común se basa en el conteo de fotones individuales correlacionado en el tiempo (TCSPC), una técnica que mejora la precisión de la medición y minimiza el impacto del ruido de fondo.
"Usando equipos TCSPC comerciales, la resolución temporal de la curva de decaimiento de la fluorescencia puede alcanzar los 405 femtosegundos".
Ámbito de aplicación
La tecnología FLIM ofrece ventajas únicas en el estudio de las células vivas y su microambiente. Esta tecnología puede distinguir diferentes movimientos moleculares a escala nanométrica y puede utilizarse para estudiar interacciones biomoleculares, cambios en la actividad enzimática intracelular, etc.
En los últimos años, la tecnología FLIM se ha aplicado aún más al diagnóstico médico, especialmente en la cirugía de tumores cerebrales, donde se puede combinar con endoscopios para implementar un diagnóstico en tiempo real. Al medir la vida útil de la fluorescencia del tejido tumoral, los médicos pueden evaluar con mayor precisión los límites y las propiedades del tumor.
Análisis de datos y perspectivas futurasEn el análisis de imágenes FLIM, la extracción de curvas de desintegración pura y la estimación de la vida útil de la fluorescencia son tareas clave. En este sentido, se han propuesto una variedad de algoritmos, ya sea el método de mínimos cuadrados o el método de determinación rápida de la vida, que mejoran constantemente la precisión y la practicidad del cálculo.
"El desarrollo de estos métodos ha transformado FLIM de una teoría de laboratorio a un método más práctico y conveniente, permitiendo que esta tecnología ingrese a la clínica".
Con el avance de la tecnología, la velocidad de adquisición de imágenes de FLIM seguirá aumentando y el alcance de aplicación será más amplio. Ya sea en la investigación científica básica o en el diagnóstico clínico, no se puede ignorar el potencial de esta tecnología. Sin embargo, a medida que se expanden sus áreas de aplicación, necesitamos pensar en cómo combinar mejor la tecnología FLIM con otras técnicas para promover el desarrollo y la innovación de la biomedicina.
