Cecilia Costa

Standard methods for maintaining adult Apis mellifera in cages under in vitro laboratory conditions

Summary Adult honey bees are maintained in vitro in laboratory cages for a variety of purposes. For example, researchers may wish to perform experiments on honey bees caged individually or in groups to study aspects of parasitology, toxicology, or physiology under highly controlled conditions, or they may cage whole frames to obtain newly emerged workers of known age cohorts. Regardless of purpose, researchers must manage a number of variables, ranging from selection of study subjects (e.g. honey bee subspecies) to experimental environment (e.g. temperature and relative humidity). Although decisions made by researchers may not necessarily jeopardize the scientific rigour of an experiment, they may profoundly affect results, and may make comparisons with similar, but independent, studies difficult. Focusing primarily on workers, we provide recommendations for maintaining adults under in vitro laboratory conditions, whilst acknowledging gaps in our understanding that require further attention. We specifically describe how to properly obtain honey bees, and how to choose appropriate cages, incubator conditions, and food to obtain biologically relevant and comparable experimental results. Additionally, we provide broad recommendations for experimental design and statistical analyses of data that arises from experiments using caged honey bees. The ultimate goal of this, and of all COLOSS BEEBOOK papers, is not to stifle science with restrictions, but rather to provide researchers with the appropriate tools to generate comparable data that will build upon our current understanding of honey bees.

Estimating the Density of Honeybee Colonies across Their Natural Range to Fill the Gap in Pollinator Decline Censuses

Although pollinator declines are a global biodiversity threat, the demography of the western honeybee (Apis mellifera) has not been considered by conservationists because it is biased by the activity of beekeepers. To fill this gap in pollinator decline censuses and to provide a broad picture of the current status of honeybees across their natural range, we used microsatellite genetic markers to estimate colony densities and genetic diversity at different locations in Europe, Africa, and central Asia that had different patterns of land use. Genetic diversity and colony densities were highest in South Africa and lowest in Northern Europe and were correlated with mean annual temperature. Confounding factors not related to climate, however, are also likely to influence genetic diversity and colony densities in honeybee populations. Land use showed a significantly negative influence over genetic diversity and the density of honeybee colonies over all sampling locations. In Europe honeybees sampled in nature reserves had genetic diversity and colony densities similar to those sampled in agricultural landscapes, which suggests that the former are not wild but may have come from managed hives. Other results also support this idea: putative wild bees were rare in our European samples, and the mean estimated density of honeybee colonies on the continent closely resembled the reported mean number of managed hives. Current densities of European honeybee populations are in the same range as those found in the adverse climatic conditions of the Kalahari and Saharan deserts, which suggests that beekeeping activities do not compensate for the loss of wild colonies. Our findings highlight the importance of reconsidering the conservation status of honeybees in Europe and of regarding beekeeping not only as a profitable business for producing honey, but also as an essential component of biodiversity conservation.

Conserving diversity and vitality for honey bee breeding.

Summary Beekeepers in Europe, North America and other parts of the world have repeatedly been afflicted by elevated and sometimes unexplained colony losses. Multiple factors have been considered in connection with increased winter losses. In addition to national programmes investigating possible causes for increased honey bee mortality, scientists collaborate at an international level on different aspects of bee health within the COLOSS network. Within this network, Working Group 4 explores aspects of genetic diversity in relation to the vitality and health of honey bee populations. In this paper, we briefly review the genetic diversity of honey bees in Europe, discuss the effects of beekeeping and selective breeding on honey bee populations under the aspect of genetic diversity and bee health, and review the current status of EU legislation with respect to protection of native bee populations. We introduce and discuss recent approaches in honey bee selective breeding to improve disease resistance by introducing traits related to colony vitality. Finally, we present the aims of WG4 within the COLOSS network and briefly introduce our experimental approach.

Standard methods for rearing and selection of Apis mellifera queens

Summary Here we cover a wide range of methods currently in use and recommended in modern queen rearing, selection and breeding. The recommendations are meant to equally serve as standards for both scientific and practical beekeeping purposes. The basic conditions and different management techniques for queen rearing are described, including recommendations for suitable technical equipment. As the success of breeding programmes strongly depends on the selective mating of queens, a subchapter is dedicated to the management and quality control of mating stations. Recommendations for the handling and quality control of queens complete the queen rearing section. The improvement of colony traits usually depends on a comparative testing of colonies. Standardized recommendations for the organization of performance tests and the measurement of the most common selection characters are presented. Statistical methods and data preconditions for the estimation of breeding values which integrate pedigree and performance data from as many colonies as possible are described as the most efficient selection method for large populations. Alternative breeding programmes for small populations or certain scientific questions are briefly mentioned, including also an overview of the young and fast developing field of molecular selection tools. Because the subject of queen rearing and selection is too large to be covered within this paper, plenty of references are given to facilitate comprehensive studies.

Screening of natural compounds for the control of nosema disease in honeybees (Apis mellifera)

The potential of some natural compounds (thymol, vetiver essential oil, lysozyme, resveratrol) for the control of nosema infection in honeybees was evaluated. A first trial aimed at screening substances, in candy preparations, on the basis of their toxicity to honeybees and bees’ dietary preferences. None of the tested substances showed an increased bee mortality or decreased bee preference, and were therefore considered suitable for further testing. In the second trial the effects of the natural compounds on nosema diseased honeybees were evaluated: bees were individually dosed with nosema spores and fed candies prepared with the screened substances. The results showed that bees fed with thymol and resveratrol candies had significantly lower infection rates, and bees supplied with resveratrol prepared candy also lived significantly longer. We suggest that thymol and resveratrol could be useful in alternative strategies for the control of nosema disease.ZusammenfassungEffektive Wirkstoffe zur Bekämpfung der Nosemose werden europaweit dringend benötigt, da es keine zugelassenen Präparate gibt und sich die Krankheit zunehmend ausbreitet. Die Nosemose ist ein weltweites Problem für die Bienenhaltung. Die Krankheit wird durch die Mikrosporidien Nosema apis Zander und Nosema ceranae Fries verursacht, wobei sie als obligate Parasiten des Darmepithels die adulten Bienen schädigen. Die Ansteckung erfolgt über Sporen, die in großer Menge im Kot von kranken Bienen nachweisbar sind. Sie sind länger als ein Jahr in Waben und Wasser infektiös und können zusätzlich über Trophallaxis verbreitet werden. Das einzige bisher wirksame Produkt zur Bekämpfung der Nosemose ist das Antibiotikum Fumagillin, das aber in vielen Ländern verboten ist. Das Ziel dieser Untersuchung war es, verschiedene Naturstoffe, die ohne das Risiko einer Rückstandsbildung in Bienenprodukten eingesetzt werden können, hinsichtlich ihrer Wirksamkeit gegen die Nosemose zu testen. Da von Thymol, Vetiveröl, Lysozym und Resveratrol bereits Berichte über inhibitorische Wirkungen auf Mikrosporidien vorlagen, wurden diese für die Tests ausgewählt und den Bienen über das Futter appliziert. In einem ersten Versuch wurden die Substanzen in zwei unterschiedlichen Konzentrationen hinsichtlich der toxischen Effekte und ihrer Akzeptanz als Futterzusatz geprüft. Jeweils 20 Bienen wurden in kleinen Holzkäfigen bei 33 °C und 70 % RF im Dunkeln gehalten und die Futterabnahme sowie die Anzahl toter Bienen bis zum elften Tag erfasst. Dabei wurden keine Unterschiede zwischen den unterschiedlich gefütterten Versuchsgruppen festgestellt (Abb. 1, 2). In einem zweiten Versuch wurden Nosema-freie Bienen einzeln mit 1 μL einer sporenhaltigen Zuckerlösung mit jeweils 18000 N. ceranae Sporen gefüttert. 30 Bienen pro Käfig wurden mit Zuckerteig, der jeweils die höchste getestete Konzentration der o. a. Substanzen enthielt, gefüttert. Aus jedem Käfig wurden 8, 13, 19 und 25 Tage nach Versuchsbeginn je 2 Bienen entnommen und deren Sporenbelastung bestimmt, um die Entwicklung der Nosemainfektion zu verfolgen. Zusätzlich wurde täglich die Anzahl toter Bienen registriert, um die Überlebensraten zu berechnen. Die mit Resveratrol gefütterten Bienen wiesen eine signifikant höhere mittlere Überlebenszeit auf (Abb. 3, Tab. II). Bei Bienen, die mit Resveratrol und Thymol gefüttert wurden, kam es am letzten Untersuchungszeitpunkt (Tag 25) zu einer Reduzierung des Nosema-Infektionsgrades, während in den anderen Gruppen die Anzahl an Sporen zunahm (Tab. III). Bei den mit Thymol gefütterten Bienen war die Sporenkonzentration zu allen Untersuchungszeitpunkten am geringsten. Es scheint, dass Thymol und Resveratrol geeignete Substanzen sind, um die Entwicklung des Parasiten zu hemmen. Thymol wird bereits als wirksames Akarizid gegen Varroa-Milben in der Imkerpraxis eingesetzt und Resveratrol ist bekannt für seine spezifischen antioxidativen Eigenschaften, die in anderen Versuchen bereits zur Verlängerung der Lebensdauer kleiner Invertebraten geführt haben.

The influence of genetic origin and its interaction with environmental effects on the survival of Apis mellifera L. colonies in Europe

Summary The survival and performance of 597 honey bee colonies, representing five subspecies and 16 different genotypes, were comparatively studied in 20 apiaries across Europe. Started in October 2009, 15.7% of the colonies survived without any therapeutic treatment against diseases until spring 2012. The survival duration was strongly affected by environmental factors (apiary effects) and, to a lesser degree, by the genotypes and origin of queens. Varroa was identified as a main cause of losses (38.4%), followed by queen problems (16.9%) and Nosema infection (7.3%). On average, colonies with queens from local origin survived 83 days longer compared to non-local origins (p < 0.001). This result demonstrates strong genotype by environment interactions. Consequently, the conservation of bee diversity and the support of local breeding activities must be prioritised in order to prevent colony losses, to optimize a sustainable productivity and to enable a continuous adaptation to environmental changes.

Occurrence of parasites and pathogens in honey bee colonies used in a European genotype-environment interactions experiment

Summary Diseases are known to be one of the major contributors to colony losses. Within a Europe-wide experiment on genotype—environment interactions, an initial 621 colonies were set up and maintained from 2009 to 2012. The colonies were monitored to investigate the occurrence and levels of key pathogens. These included the mite Varroa destructor (mites per 10 g bees), Nosema spp. (spore loads and species determination), and viruses (presence/absence of acute bee paralysis virus (ABPV) and deformed wing virus (DWV)). Data from 2010 to the spring of 2011 are analysed in relation to the parameters: genotype, environment, and origin (local vs. non-local) of the colonies in the experiment. The relative importance of different pathogens as indicators of colony death within the experiment is compared. In addition, pathogen occurrence rates across the geographic locations are described.

Effect of thymol and resveratrol administered with candy or syrup on the development of Nosema ceranae and on the longevity of honeybees (Apis mellifera L.) in laboratory conditions

The aim of this study was to evaluate the effect of thymol and resveratrol administered in two different formulation modes (candy and syrup) on the development of Nosema ceranae and on the longevity of honey bees. Emerging bees from a nosema-free apiary were individually infected with 1 μL of sucrose syrup containing 18000 spores of N. ceranae, placed in cages, and kept in an incubator at 33 °C and 65% RH. The experimental groups were fed candy or syrup prepared with thymol (100 ppm) or resveratrol (10 ppm). Infection levels were monitored over a 25 day period by removal and dissection of two live bees per cage. On day 25, post-infection bees fed with thymol syrup had significantly lower levels of infection (60 ± 9 million spores/bee) compared to control bees (138 ± 7 million spores/bee). Bees fed with thymol or resveratrol syrup lived significantly longer (23 and 25 days, respectively) than bees fed with control syrup (20 days). Thymol treated syrup appears to be promising in the control of nosema infection.ZusammenfassungDer Parasit Nosema ceranae, ursprünglich von der asiatischen Honigbiene Apis cerana stammend, ist in den letzten Jahren in Honigbienen europäischer Abstammung auf der ganzen Welt nachgewiesen worden und wird von einigen Autoren auch für den plötzlichen Zusammenbruch von Völkern verantwortlich gemacht. In einem vorhergegangenen Experiment untersuchten wir einige natürliche Substanzen auf ihre Wirkung auf eine Nosema-Infektion und fanden einen vielversprechenden hemmenden Effekt von Thymol und Resveratrol, die in Zuckerteig verabreicht wurden. In dieser Untersuchung verglichen wir den Effekt von Thymol (100 ppm) und Resveratrol (10 ppm) auf den Infektionsverlauf von künstlich mit N. ceranae infizierten Bienen in zwei verschiedenen Verabreichungsformen, Zuckerteig und Sirup.Frisch geschlüpfte Nosema-freie Arbeiterinnen wurden individuell mit 1 μL Saccharosesirup gefüttert, der 18 000 N. ceranae Sporen enthielt. Die Entwicklung der Infektion wurde beobachtet, indem aus jedem Käfig zu den Beobachtungszeitpunkten an Tag 8, 13, 19 und 25 p.i. zwei lebende Bienen entnommen und seziert wurden; die Zahl der toten Bienen wurde täglich protokolliert. Die Ergebnisse der Überlebensanalyse (Abb. 1, Tab. I) zeigten, dass 12 Tage nach Beginn des Experiments in allen Gruppen noch etwa 90 % der Bienen am Leben waren, unabhängig von der verabreichten aktiven Substanz oder der Verabreichungsform. Am Ende des Experiments gab es dagegen deutliche Unterschiede zwischen den Behandlungsformen, da Bienen, die mit Sirup gefüttert wurden, der Thymol oder Resveratrol enthielt, signifikant länger überlebten (Median der Überlebenszeit 23 Tage, bzw. 25 Tage) als Bienen, die Kontrollsirup erhielten (Median der Überlebenszeit 20 Tage) oder Bienen, die mit Kontroll-Zuckerteig oder Substanz-Zuckerteig gefüttert wurden.Die Sporenbelastungen am letzten Beobachtungszeitpunkt (25 d) waren signifikant unterschiedlich, wobei Bienen, die mit Thymol-Sirup oder — Teig gefüttert wurden, am wenigsten Sporen hatten (Tab. II). Bei Bienen, die mit Thymol gefüttert wurden, war die Entwicklung der Infektion deutlich langsamer als in den anderen Gruppen. Am Ende des Experiments traten die höchsten bzw. niedrigsten Infektionsniveaus bei Kontrollzuckerteig bzw. Thymolsirup auf (138,33 ± 6,74 bzw. 60,16 ± 9,17 Millionen Sporen pro Biene ± SE). Thymol, entweder in Sirup oder in Zuckerteig verabreicht, war deutlich in der Lage, die Entwicklung von N. ceranae im Mitteldarm zu verzögern. Es wurde vermutet, dass Thymol die Entwicklung der Infektion durch Perforation der Plasmamembran behindert. Die von jeder Biene durchschnittlich täglich aufgenommene Dosis war 3,2 × 10−3 mg: diese Menge erschien ausreichend, um die Entwicklung der Infektion zu verhindern. Das längere Überleben der mit Resveratrol gefütterten Bienen, in denen die Sporenbelastung sich nicht von den Kontrollbienen unterschied, könnte durch die spezifischen lebens verlängernden anti-oxidativen Eigenschaften dieser Substanz erklärt werden. In der Tat konnte gezeigt werden, dass Resveratrol die Lebensspanne einiger Invertebraten verlängern kann, indem es Enzyme aktiviert, die das Überleben von Zellen fördern. Das Füttern von Bienenvölkern mit Thymol könnte eine effektive Maßnahme sein, um Nosema-Infektionen zu vermindern.

Acaricide residues in beeswax after conversion to organic beekeeping methods

Beekeepers interested in converting their honey farms to organic management must replace old combs with organic foundations. The experiment described in this paper compares two methods of replacement of old combs, “fast” (5 combs per year) and “slow” (2 combs per year), by measuring the levels of acaricide residues in the newly built combs. Tested acaricides were coumaphos (Perizin and Asuntol), fluvalinate (Apistan), and chlorfenvinphos (Supona). Significant differences between the two replacement groups were observed only for the Apistan group in the third year, confirming high lipophilicity of fluvalinate. The residue levels in the new combs three years after beginning the conversion were significantly lower than initial levels for all products. Direct contamination of the combs was highest in Asuntol-treated hives and lowest in Perizin-treated hives. Residues in honey exceeding EU Maximum Residue Limit were found only in the case of Asuntol.ZusammenfassungDie ökologische Bienenhaltung hat in Italien seit Einführung der Richtlinien der Europäischen Gemeinschaft zur ökologischen Tierhaltung (Reg. N. 1804/1999, nun ersetzt durch Reg. N. 834/2007) zugenommen. Zur Umstellung müssen Bienenhalter alte Waben innerhalb von drei Jahren durch rückstandsfreie Mittelwände ersetzen. Auf Grund der fettlöslichen Natur der meisten Milbenbehandlungsmittel reichern sich Rückstände im Wachs an und neue Waben sind dem Risiko einer indirekten Kontamination ausgesetzt. In dem in diesem Artikel beschriebenen Experiment wurden zwei Umstellungsmethoden verglichen, bei denen der Ersatz der alten durch neue Waben über zwei oder mehr Jahre hinweg stattfand. Die von den italienischen Imkern am häufigsten verwendeten Akarizide wurden in Betracht gezogen, darunter auch kommerzielle Produkte, die für die Anwendung bei Honigbienen nicht zugelassen sind: Coumaphos (Perizin und Asuntol), Fluvalinat (Apistan), Chlorfenvinphos (Supona) (Tab. I). Das rasche Auswechseln der Waben führte im dritten Jahr der ökologischen Bienenhaltung nur bei Apistan zu einer verringerten insgesamten Kontamination (Tab. IV), dies ist vermutlich auf die hohe Lipophilie von Fluvalinat zurückzuführen. Die erhaltenen Daten wurden zusätzlich genutzt, um direkte und indirekte Kontamination durch die untersuchten Akarizide zu vergleichen. Die Analyse der während der nichtökologischen Bienenhaltung in den Völkern vorhandenen Waben zeigte, dass die Kontamination bei Asuntol am höchsten war, während sie in den mit Perizin behandelten Völkern am geringsten war (Tab. III). Die indirekte Kontamination von neu gebauten Waben war bei Perizin am höchsten (∼ 83 %) und lag bei den anderen Akariziden zwischen 20 % und 30 % (Tab. III). Der Rückstandsgehalt der frisch gebauten Waben drei Jahre nach der Umstellung war bei allen Produkten signifikant geringer als der Anfangsgehalt, in den meisten Fällen lag er unterhalb der von den ökologischen Kontrollinstanzen übergangsweise zugelassenen Grenzwerten. Die indirekte Kontamination des Honigwabenwachses während der nichtökologischen Bienenhaltung war in den mit Asuntol behandelten Völkern am höchsten. Neue, während des Experiments auf rückstandsfreien Mittelwänden gebaute Waben wurden ebenfalls kontaminiert, allerdings war der Rückstandgehalt im dritten Jahr nach Beginn der Umstellung sehr gering oder nicht mehr nachweisbar. Im Honig wurden die EU MRL überschreitenden Rückstandsgehalte ausschließlich in dem mit Asuntol behandelten Bienenstand und nur im ersten Jahr des Experimentes gefunden.

Population dynamics of European honey bee genotypes under different environmental conditions

Summary Adaptation of honey bees to their environment is expressed by the annual development pattern of the colony, the balance with food sources and the host—parasite balance, all of which interact among each other with changes in the environment. In the present study, we analyse the development patterns over a period of two years in colonies belonging to 16 different genotypes and placed in areas grouped within six environmental clusters across Europe. The colonies were maintained with no chemical treatment against varroa mites. The aim of the study was to investigate the presence of genotype—environment interactions and their effects on colony development, which we use in this study as a measure of their vitality. We found that colonies placed in Southern Europe tend to have lower adult bee populations compared to colonies placed in colder conditions, while the brood population tends to be smaller in the North, thus reflecting the shorter longevity of bees in warmer climates and the shorter brood rearing period in the North. We found that both genotype and environment significantly affect colony development, and that specific adaptations exist, especially in terms of adult bee population and overwintering ability.