Christian Ewering

Genome sequence of the bioplastic-producing “Knallgas” bacterium Ralstonia eutropha H16

The H2-oxidizing lithoautotrophic bacterium Ralstonia eutropha H16 is a metabolically versatile organism capable of subsisting, in the absence of organic growth substrates, on H2 and CO2 as its sole sources of energy and carbon. R. eutropha H16 first attracted biotechnological interest nearly 50 years ago with the realization that the organisms ability to produce and store large amounts of poly[R-(–)-3-hydroxybutyrate] and other polyesters could be harnessed to make biodegradable plastics. Here we report the complete genome sequence of the two chromosomes of R. eutropha H16. Together, chromosome 1 (4,052,032 base pairs (bp)) and chromosome 2 (2,912,490 bp) encode 6,116 putative genes. Analysis of the genome sequence offers the genetic basis for exploiting the biotechnological potential of this organism and provides insights into its remarkable metabolic versatility.

Establishment of a novel anabolism-based addiction system with an artificially introduced mevalonate pathway: complete stabilization of plasmids as universal application in white biotechnology.

Plasmid stability in recombinant microorganisms is a very important requirement for highly efficient plasmid-based production processes in biotechnology. To stably maintain plasmids, we developed in this study an efficient and stringent novel anabolism-based addiction system, which can be widely used. This novel addiction system is based on two components: (i) an Escherichia coli HMS174(DE3) knockout mutant of the ispH gene coding for 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (EC 1.17.1.2) of the deoxyxylulose 5-phosphate (DXP) pathway, impairing the synthesis of isopentenyl pyrophosphate (IPP) and (ii) a completely synthetic and episomal mevalonate (MVA) pathway as an alternative supplier of essential IPP. The latter is encoded by a plasmid that contains the genes for HMG-CoA reductases from Lactococcus lactis and Staphylococcus aureus plus HMG-CoA-synthase, MVA kinase, MVP kinase and MVPP decarboxylase from S. aureus. This plasmid should then also harbor the genes for the protein or for the pathway that will be produced or that will be utilized for production of a chemical. To demonstrate the functionality of this addiction system, a mutated cyanophycin synthetase gene (cphA(6308)C595S) was used. To determine plasmid stabilities, flasks experiments in media supplied or not supplied with antibiotics were carried out with the knockout mutant and two control strains, one harboring plasmid pCOLADuet-1::MVA1-5::cphA(6308) and the other harboring a conventional expression plasmid pET-23a::cphA(6308). As revealed by measuring the colony-forming units of aliquots spread on solid media with or without antibiotics, the knockout mutant revealed a plasmid stability of 100% whereas the control strains exhibited plasmid stabilities of only 64% and 2%, respectively. Radiometric enzyme activity measurements for CphA revealed only 95% and 12.5% of the activity in the control strains harboring pCOLADuet-1::MVA1-5::cphA(6308) and pET-23a::cphA(6308), respectively, in comparison to the activity measured in the knockout mutant. The knockout mutant synthesized 9.5% (w/w of cell dry weight (CDW)) of cyanophycin, and the control strain harboring pCOLADuet-1::MVA1-5::cphA(6308) synthesized 13.6% (w/w of CDW) after growth without antibiotics.

Identification of novel sulfur-containing bacterial polyesters: biosynthesis of poly(3-hydroxy-S-propyl-omega-thioalkanoates) containing thioether linkages in the side chains.

This study describes the biosynthesis of novel sulfur-containing polyhydroxyalkanoates (PHAs), which consist exclusively of hydroxypropylthioalkanoic acid containing thioether groups in the side chains. In addition, the utilization of alkylthioalkanoic acids (=thia fatty acids) by various bacteria was investigated. Based on feedings with propylthiooctanoic acid (PTO) or propylthiohexanoic acid, the metabolically engineered PHA-negative mutant PHB(-)4 of Ralstonia eutropha, which harbours plasmid pBBR1::phaC1 expressing the PHA synthase of Pseudomonas mendocina, synthesized two novel poly(3-hydroxy-S-propyl-omega-thioalkanoic) acids [poly(3HPTA)s]. A terpolyester consisting of 3-hydroxypropylthiobutyric acid (3HPTB), 3-hydroxypropylthiohexanoic acid (3HPTHx) and 3-hydroxypropyl- thiooctanoic acid (3HPTO) was synthesized from PTO, whereas a co-polyester of 3HPTB and 3HPTHx was synthesized from propylthiohexanoic acid. Fed-batch fermentation of R. eutropha PHB(-)4(pBBR1::phaC1) on PTO was done on a 26-litre scale, providing a cell density of 7.3 g l(-1), from which 45 g of the novel poly(3HPTB-co-3HPTHx-co-3HPTO) were isolated. The chemical structures of the poly(3HPTA)s were identified by gas chromatography/mass spectrometry, elemental sulfur analysis, partial pyrolysis and detailed mass spectrometric analysis, exhibiting 3HPTB, 3HPTHx and 3HPTO as constituents. These novel, hitherto undescribed, constituents of PHAs were randomly distributed in the co-polyesters.

Überblick über die Mikroorganismen

Zu Beginn des Mikrobiologischen Praktikums sollen einige einfuhrende Anmerkungen gemacht werden, welche die in jeglicher Hinsicht auserordentlich grose Diversitat der Mikroorganismen verdeutlichen und einen Uberblick uber die verschiedenen Gruppen der Mikroorganismen und ihre Lebensweisen geben. Die letzte offizielle Bilanzierung des taxonomischen Standardwerkes Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology aus dem Jahre 2003 wies exakt 6466 validierte Spezies aus, beim Schreiben dieser Auflage ist die Zahl auf rund 9000 gestiegen (angegeben in der List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature, http://www.bacterio.cict.fr ). Bakterien zeichnen sich durch eine ungewohnlich grose Vielfalt aus. Entgegen haufig getatigten Auserungen betrifft dies sogar die Zellmorphologie und die Zellgrose. Besonders vielseitig ist der Stoffwechsel der Bakterien. Hier gibt es zahlreiche Stoffwechselleistungen, die ausschlieslich von Prokaryonten katalysiert werden konnen (Monopole der Prokaryonten) und ohne die ein Leben auf unserem Planeten auf lange Sicht nicht moglich ware. Diese kurzen Ausfuhrungen konnen die Lekture von Lehrbuchern der Mikrobiologie nicht ersetzen; sie sollen jedoch auf das Mikrobiologischen Praktikums einstimmen und einige besondere Aspekte beim Umgang mit Mikroorganismen hervorheben.

Modulare Zusammenstellung von Versuchen für unterschiedliche Zielgruppen

In der nachfolgenden Tabelle (◉ Tab. 7.1) sind samtliche im Mikrobiologischen Praktikum beschriebenen Versuche, Exkursionen und Demonstrationen aufgefuhrt. Daneben sind acht Zielgruppen bzw. Ausbildungsrichtungen aufgefuhrt, denen Versuche zugeordnet sind, die uns fur die jeweilige Zielgruppe bzw. Ausbildungsrichtung besonders geeignet erscheinen (✓). Die Abschatzung der Durchfuhrbarkeit basiert auf Erfahrungswerten und berucksichtigt die fur die Versuche notwendigen Geratschaften sowie den Kenntnisstand der Teilnehmer.

Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien

Die unten aufgefuhrte Liste der Medien, die im Mikrobiologischen Praktikum Verwendung finden, verzichtet zugunsten der Ubersichtlichkeit auf das detaillierte Beschreiben der Zubereitungsweisen. Fur Ungeubte und Anfanger auf dem Gebiet sei auf die Methoden 1 und 2 verwiesen; dort sind allgemeingultige Ratschlage hierzu aufgefuhrt.

Vorschriften und Gesetze im Zusammenhang mit mikrobiologischen Arbeiten

Der Umgang mit Mikroorganismen ist in Deutschland durch ein dichtes Netz von Gesetzen und Verordnungen geregelt. Die fur das MIKROBIOLOGISCHE PRAKTIKUM relevanten Bestimmungen werden im Folgenden erlautert. In anderen Staaten (z. B. Osterreich oder Schweiz) gelten andere Gesetze und Vorschriften.

Exkursionen und Demonstrationen von Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

Botaniker und Zoologen konnen eine Vielzahl unterschiedlichster Pflanzen und Tiere direkt vor der „Haustur“ einsammeln, um sie im Praktikum zu demonstrieren und in vielfaltiger Art und Weise untersuchen zu lassen. Auch sind Zoologische und Botanische Garten verbreitet. Dagegen scheint es auf den ersten Blick schwierig zu sein, Mikroorganismen an ihren naturlichen Standorten ausfindig zu machen und deren Leistungen zu demonstrieren. In diesem Abschnitt des Buches stellen wir gewerbliche und kommunale Einrichtungen sowie naturliche Standorte vor, an denen Mikroorganismen „besichtigt“ werden konnen.