Eugen Carasevici

The Effects of Adipose-Derived Stem Cell-Differentiated Adipocytes on Skin Burn Wound Healing in Rats.

Both adipose-derived stem cells (ADSCs) and fat grafting promote burn wound healing, but whether adipogen-derived cells using various inducers such as 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) and insulin affect wound healing is unknown. Herein, ADSC-differentiated adipogenic lineages were used in rat burn wounds to evaluate wound healing potential. ADSCs were cultivated using six different adipogenic differentiation conditions (IBMX ± insulin, IBMX for 5 days, high and low Dulbecco’s modified Eagle’s medium) and in vitro morphological changes and cell proliferations during adipogenic differentiation were recorded. Intermediate burn wounds were inflicted in 15 Wistar male rats. Afterwards, the rats were divided into five groups for subcutaneous injections under the wounds: control; ADSCs; differentiated adipocytes (−IBMX+INSULIN and +IBMX[D1–5]+INSULIN) and fat prepared by Coleman technique. Macroscopic changes and histology were documented for 3 weeks. Repeated measures analysis of variance was performed to analyze cell growth and wound healing with a statistical level set of P < .05. Induction cocktails significantly reduced proliferation and induced lipid droplet accumulation. Conditioning without insulin induced the least lipid accumulation, while discontinuing IBMX generated larger adipocytes (P < .001). Adipogenic differentiated ADSCs had similar wound healing abilities with ADSC and fat injections, but differentiated adipocytes (+IBMX[D1–5]+INSULIN) and fat grafting accelerated the early healing process relative to ADSC (P < .001). Reduced fibrosis and mild inflammatory infiltration limited to superficial dermis were observed in +IBMX(D1–5)+INSULIN and fat injection groups, while those reactions were mild to moderate in ADSC group. Differentiated adipocytes achieve similar wound healing results compared with ADSC and fat injections, but differentiated adipocytes (+IBMX[D1–5]+INSULIN) and fat grafting accelerate early healing relative to ADSC.

Specific Associations Between Clinical Signs, Immune Cells, Disease Genetic Background and Burden in a Group of Patients with B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia

Abstract Traffic of tumor- and normal cells through the peripheral blood (PB) of patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) to the lymph nodes (LN) or spleen/ liver sites is governed by specific changes in surface and intracellular molecule expression. The study aims to investigate the potential association between different lymphocyte subsets, chemokine receptors or genetic alterations and specific clinical signs in a group of B-CLL patients. Forty-three patients were included in the study. The expression of CCR7, CXCR5, CXCR3, CCR4, CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD25, CD127, CD38 was tested by multiparameter flow cytometry. Genetic alterations were determined by MLPA. We found increased frequency of CD38+ B-CLL cells directly correlated with the presence of LN>5cm. CXCR5 and CCR7 are homogenously expressed by monoclonal B-CLL cells. CCR4+ B-CLL cell frequency is found to be lower in the PB of patients presenting particular LN involvement. Heterogeneous and complex genetic alterations were found and only the presence of trisomy 12 associated with less frequent axillary LN involvement. We also report a significant increase in the frequency of total T cells and T cell subsets (effector- and central memory CD4+ T cells, regulatory T cells, follicular T helper cells, distinct functional CD8+ T cells) with the occurrence of specific clinical manifestations. Chemokine receptor expression on circulating CD4+ T cell subsets was augmented in connection to some specific LN locations. Consequently, clinical manifestations in B-CLL are linked to both, factors intrinsic to the monoclonal B cells, and external influences coming from the microenvironment. Rezumat Traficul limfocitelor maligne și normale prin sângele periferic (PB) către ganglioni, splina și ficat este guvernat de modificări specifice ale nivelelor de expresie de suprafață/ intracelulară a unor molecule. Studiul își propune să investigheze asocierea dintre diferite subseturi limfocitare, receptori pentru chemokine sau aberații genetice și anumite simptome clinice la pacienți cu LLC-B. Patruzeci și trei de pacienți au fost incluși în studiu. Prin citometrie în flux multiparametrică a fost testată expresia pentru CCR7, CXCR5, CXCR3, CCR4, CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD25, CD127, CD38. Defectele genetice au fost determinate prin MLPA. Am observat o frecvență crescută a celulelor CD38+ clonale corelată cu infiltrarea ganglionilor>5cm. CXCR5 si CCR7 sunt omogen exprimați de celulele de LLC-B. Frecvența celulelor B CCR4+ este redusă la pacienții cu un anumit tip de infiltrare ganglionară. Am detectat aberații genetice heterogene și complexe și trisomia 12 este mai frecventă la pacienții ce nu prezintă ganglioni axilari. Deasemenea, frecvența limfocitelor T totale și a unor subseturi (memorie efector și centrală, T reglatorii, T helper foliculare, diferite subseturi funcționale CD8+) este crescută doar concomitent cu prezența anumitor manifestări clinice. Expresia receptorilor pentru chemokine la nivelul limfocitelor T CD4+ este crescută în conexiune cu anumite localizări ganglionare. În concluzie, manifestările clinice la pacienții cu LLC-B sunt în strânsă legatură atât cu factori intrinseci limfocitelor B clonale, cât și de influențe externe, furnizate de semnale provenite din micromediu.

Flow Cytometry Analysis of Pparα Receptors in Metabolic Syndrome / Studiul Receptorilor Pparα prin Metoda Citometriei în Flux în Sindromul Metabolic

Abstract Introduction. Metabolic syndrome (MS) is a cluster of distinct metabolic alterations with an increased cardiovascular risk. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor - Alpha (PPARα), member of the nuclear receptor superfamily of transcription factors, is critically involved in the management of lipid metabolism during homeostasis or inflammatory stresses in various cell types and represents one of the therapeutic targets in MS. We analysed the PPARα expression in leukocytes of pacients with MS, in order to address PPARα involvement in these group of diseases. Material and method. Our study included 57 adult patients recruited under informed voluntary consent, investigated in order to establish whether they present MS, according to International Diabetes Federation (IDF) European guidelines and grouped in 2 lots: the MS Lot (26 patients) and control group, non-MS Lot (31 subjects). Common clinical and laboratory parameters targeted in MS evaluation were determined for all the studied cases. The expression levels of 2 molecules, PPARα and CD36 were evaluated in various circulating leukocyte populations of these patients by an optimized flow cytometry method. Statistic analysis clarifying the significance of value differences for various parameters measured was performed under SPSS and simple statistical tests (Pearson, t-Student, Chi -test). Results and discussion. The fluorescence staining for PPARα were significantly dimmer when comparing the cellular expression in eosinophils (p<0.05) of MS versus the Control group of subjects. Conclusions: Our study is the first to show that circulating eosinophils display significantly reduced PPARα protein expression in MS patients. The differences in key molecule expression in circulating leukocytes (like PPAR species, CD36, and other) might be evocatory for the endothelial dysfunction and obesity and might be of use in the therapeutic decision. Rezumat Introducere. Sindromul metabolic (SM) reprezintă o asociere de alterări metabolice independente cu risc cardiovascular crescut. Receptorii activați de inductorii proliferării peroxizomilor-alpha (PPARα), membri ai superfamiliei receptorilor nucleari cu rol de factori de transcripţie , sunt implicați în reglarea metabolismului lipidic și inflamație în diferite tipuri de celule și reprezintă una din țintele terapeutice în SM. Am analizat expresia PPARα în leucocitele pacienților cu SM, îndreptându-ne spre implicarea PPARα în această patologie. Material și metoda. Studiul s-a desfășurat pe un număr de 57 pacienți adulți recrutați după semnarea consimțământului informat, investigați pentru evidențierea SM conform criteriilor Federației Internaționale de Diabet (IDF) și care au fost grupați în două loturi: lotul SM (26 pacienți) și lotul de control, fără SM (31 subiecți). Au fost determinați parametrii clinici și de laborator utilizați curent în evaluarea SM. În populațiile de leucocite circulante ale pacienților au fost evaluate nivelurile de expresie a două molecule, PPARα și CD36, printr-o metodă optimizată de citometrie în flux . Semnificația diferențelor dintre valorile parametrilor măsurați a fost stabilită prin analiza statistică, utilizând programul SPSS și teste statistice simple (Pearson, t-Student, Chi-test). Rezultate și discuții. Când am comparat nivelul de expresie a PPARα în eozinofile, am obținut a reducere semnificativă a intensității medie de fluorescență (p<0.05) pentru PPARα în lotul MS versus lotul martor. Concluzii. Studiul nostru este primul care arată că nivelul de expresie a PPARα în eozinofile este diminuat semnificativ la pacienții cu SM. Diferențele de expresie ale acestor molecule cheie în leucocitele circulante (ca diferite specii de PPAR, CD36 și altele) ar putea deveni evocatoare pentru disfuncția endotelială și obezitate și ar putea fi utile în elaborarea unei decizii terapeutice.

Optimisation of the quantitative analysis of inflammatory cell infiltrates in breast cancer /Optimizarea analizei cantitative a infiltratului celular inflamator în cancerul mamar

Abstract In this study we aimed to determine the optimal cut-off point for the quantitative analysis of inflammatory infiltrates in breast cancer, using the HistoQuest system. We used samples of tumour breast tissue which were IHC stained with CD68 and CD8 and subsequently tested with automated systems on three regions: intratumoral, invasive front and peritumoral, using the HistoQuest system. In order to delimit between positive and negative cells on histograms and scattergrams, we need to set a cut-off value. We compared 5 cut-off types for optimisation of the quantitative analysis. The results obtained statistically for the CD8 marker for all 5 types of cut-offs applied on IT, PT and IF regions did not show statistically significant differences (p > 0.05). As for the CD68 marker, we found statistically significant differences (p < 0.05) between manual cut-offs (C2 - manual and C3 - manual, arithmetic mean) and automated cut-offs placed by the software (C1 - automated, C4 - negative region, and C5 - automated, arithmetic mean), which suggests that the use of an automated cut-off should be preferred in order to remove the subjective factor. The automated cut-off setting generates objective and reproducible data and can be used in subsequent quantitative analyses. Rezumat În acest studiu am analizat modalitatea optimă de poziţionare a cut off-ului în cadrul analizei cantitative a infiltratului inflamator în cancerul mamar cu ajutorul sistemului HistoQuest. Am utilizat specimene de ţesut mamar tumoral, care au fost marcate imunohistochimic cu markerii CD68 (pentru macrofage) şi CD8 (pentru limfocitul T citotoxic) şi ulterior analizate automat pe regiunile IT (intratumoral), PT (peritumoral) şi FI (front de invazie) cu ajutorul sistemului soft HistoQuest. Pentru evidenţierea populaţiei de celule pozitive pe histograme şi scatergrame, este necesară poziţionarea cut off-ului (discriminator). Pentru optimizarea tehnicii, am comparat 5 modalităţi de poziţionare a cut off-ului. Rezultatele obţinute statistic pentru markerul CD8 pentru toate cele 5 tipuri de cutoff aplicate pe regiunile IT, PT şi FI nu au înregistrat diferenţe semnificative statistic (p < 0,05). Pentru markerul CD68 s-au înregistrat diferenţe semnificative statistic (p<0,05) între cut off-urile alese pe criterii manuale (cut off-ul C2-manual şi cut off -ul C3-medie manual) versus cut off-urile stabilite pe criterii ce ţin de soft (cut off-ul C1-automat, cut off-ul C4-regiune negativă şi cut off-ul C5-medie automat), utilizarea cutoff-ului automat fiind preferat pentru a îndepărta factorul subiectiv. Utilizarea modalităţii de poziţionare automată a cut off-ului generează date obiective şi reproductibile şi poate fi utilizat în analize cantitative ulterioare