Roxana Popescu

Specific Associations Between Clinical Signs, Immune Cells, Disease Genetic Background and Burden in a Group of Patients with B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia

Abstract Traffic of tumor- and normal cells through the peripheral blood (PB) of patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) to the lymph nodes (LN) or spleen/ liver sites is governed by specific changes in surface and intracellular molecule expression. The study aims to investigate the potential association between different lymphocyte subsets, chemokine receptors or genetic alterations and specific clinical signs in a group of B-CLL patients. Forty-three patients were included in the study. The expression of CCR7, CXCR5, CXCR3, CCR4, CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD25, CD127, CD38 was tested by multiparameter flow cytometry. Genetic alterations were determined by MLPA. We found increased frequency of CD38+ B-CLL cells directly correlated with the presence of LN>5cm. CXCR5 and CCR7 are homogenously expressed by monoclonal B-CLL cells. CCR4+ B-CLL cell frequency is found to be lower in the PB of patients presenting particular LN involvement. Heterogeneous and complex genetic alterations were found and only the presence of trisomy 12 associated with less frequent axillary LN involvement. We also report a significant increase in the frequency of total T cells and T cell subsets (effector- and central memory CD4+ T cells, regulatory T cells, follicular T helper cells, distinct functional CD8+ T cells) with the occurrence of specific clinical manifestations. Chemokine receptor expression on circulating CD4+ T cell subsets was augmented in connection to some specific LN locations. Consequently, clinical manifestations in B-CLL are linked to both, factors intrinsic to the monoclonal B cells, and external influences coming from the microenvironment. Rezumat Traficul limfocitelor maligne și normale prin sângele periferic (PB) către ganglioni, splina și ficat este guvernat de modificări specifice ale nivelelor de expresie de suprafață/ intracelulară a unor molecule. Studiul își propune să investigheze asocierea dintre diferite subseturi limfocitare, receptori pentru chemokine sau aberații genetice și anumite simptome clinice la pacienți cu LLC-B. Patruzeci și trei de pacienți au fost incluși în studiu. Prin citometrie în flux multiparametrică a fost testată expresia pentru CCR7, CXCR5, CXCR3, CCR4, CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD25, CD127, CD38. Defectele genetice au fost determinate prin MLPA. Am observat o frecvență crescută a celulelor CD38+ clonale corelată cu infiltrarea ganglionilor>5cm. CXCR5 si CCR7 sunt omogen exprimați de celulele de LLC-B. Frecvența celulelor B CCR4+ este redusă la pacienții cu un anumit tip de infiltrare ganglionară. Am detectat aberații genetice heterogene și complexe și trisomia 12 este mai frecventă la pacienții ce nu prezintă ganglioni axilari. Deasemenea, frecvența limfocitelor T totale și a unor subseturi (memorie efector și centrală, T reglatorii, T helper foliculare, diferite subseturi funcționale CD8+) este crescută doar concomitent cu prezența anumitor manifestări clinice. Expresia receptorilor pentru chemokine la nivelul limfocitelor T CD4+ este crescută în conexiune cu anumite localizări ganglionare. În concluzie, manifestările clinice la pacienții cu LLC-B sunt în strânsă legatură atât cu factori intrinseci limfocitelor B clonale, cât și de influențe externe, furnizate de semnale provenite din micromediu.

Prenatal diagnosis of 21 trisomy by quantification of methylated fetal DNA in maternal blood: study on 10 pregnancies

Abstract Background. The Down syndrome is a severe disease without pathogenic therapy. The only possibility to reduce the consequences of disease is prenatal screening and diagnosis. The gold standard in prenatal diagnosis is the conventional banding cytogenetic analysis of fetal cells obtained by invasive procedures. To reduce the complications, in the last years different methods to detect fetal cells or DNA in maternal blood were developed. Aim. The aim of study was to verify the reliability of quantification by immunoprecipitation of methylated fetal DNA in maternal blood in the prenatal diagnosis of 21 trisomy. Method. We analyzed probes from 12 pregnant women (7 with confirmed 21 trisomy pregnancy and 5 with normal pregnancy), with two being rejected for technical considerations. For each probe we carried out: extraction of total DNA (maternal and fetal), DNA fragmentation, immunoprecipitation of methylated DNA, washing, isolation of DNA and qPCR for immunoprecipitated DNA. To highlighting specific methylated regions on fetal 21 chromosome we used eight pairs of specific primers for chromosome 21. Finally we analysed the results of qPCR applying the formula D=- 6.331+0.959XEP4+1.188XEP5+0.424XEP6+0.621XEP7+0.028XEP8+0.387XEP10-0.683XEP11+ 0.897XEP12, where XEPi= fraction value for each marker. Results. In all normal pregnancies the value of D factor was negative concordant with absence of trisomy (100% specificity). In 5 from 6 pregnancies with 21 trisomy the value of D factor was positive, which indicated a high sensibility. However, to a precise estimation of this method is required a larger number of cases that allowing the obtaining of statistically validated results. Rezumat Introducere. Sindromul Down este o boală gravă, lipsită de terapie patogenică. Singurele posibilităţi de reducere a consecinţelor bolii le reprezintă screeningul şi diagnosticul prenatal. Standardul de aur în diagnosticul prenatal este analiza cromosomică a celulelor fetale obţinute prin proceduri invazive. Pentru reducerea complicaţiilor, în ultimii ani au fost dezvoltate diferite metode de detecţie a celulelor sau ADN-ului fetal în sângele matern. Scop. Scopul studiului a fost verificarea aplicabilităţii metodei de cuantificare prin imunoprecipitare a ADN-ului fetal metilat din sângele matern în diagnosticul prenatal al trisomiei 21. Metodă. Am analizat probe de la 12 gravide (7 cu făt cu trisomie 21 şi 5 cu făt euploid confirmate citogenetic), două probe fiind eliminate din considerente tehnice. Pentru fiecare probă am efectuat: extracţia ADN-ului total (matern şi fetal), fragmentarea ADN-ului, imunoprecipitarea ADN-ului metilat, spălarea, izolarea ADN-ului şi qPCR pentru ADN-ul imunoprecipitat. Pentru evidenţierea regiunilor metilate specifice pe cromosomii 21 fetali am utilizat opt perechi de amorse specifice cromosomului 21. În final, am analizat rezultatele qPCR aplicând formula: D=-6,331+0,959XEP4+1,188XEP5+0,424XEP6+0,621XEP7+0,028XEP8+0,387XEP10-0,683XEP11 +0,897XEP12 unde XEPi= valoarea fracţiei pentru fiecare marker. Rezultate. În toate sarcinile normale, valoarea factorului D a fost negativă concordant cu absenţa trisomiei (specificitate 100%). În 5 din 6 sarcini cu trisomie 21 valoarea factorului D a fost pozitivă, ceea ce indică o sensibilitate crescută. Totuşi, pentru estimarea precisă a metodei este necesară analiza mai multor cazuri, ceea ce ar permite obţinerea de date valabile statistic

Co-expression of the CBFβ-MYH11 and BCR-ABL fusion genes in chronic myeloid leukaemia / Coexistenţa genelor de fuziune CBFβ-MYH11 şi BCR-ABL în leucemia mieloidă cronică

Abstract The coexistence of t(9;22) and inv(16) has been described in a very limited number of cases of CML, de novo or therapy-related AML. We report a patient with CML who presented both inversion of chromosome 16 and Philadelphia chromosome and evolved towards the blast phase under treatment with Imatinib. Laboratory diagnosis and monitoring was made by flow cytometry, conventional cytogenetics and molecular genetics techniques. The inv(16), detected by karyotyping in the Philadelphia chromosome positive clone at the moment of the blast transformation, was retrospectively assessed by means of real-time PCR, and was proved to have been present since diagnosis. The bone marrow biopsy performed in the blast phase of CML confirmed the presence of blasts belonging to the myeloid lineage, with indications of monocytic differentiation, frequently associated with inv(16). Moreover, the case also associated a F359V tyrosine kinase domain mutation, resulting in intermediate resistance to Imatinib and Nilotinib, which imposed therapy-switch to Dasatinib. In our case the evolution was progressive, followed by death due to lack of response to tyrosine kinase inhibitors, 18 months after diagnosis. The coexistence of t(9;22) and inv(16) in CML seems to be associated with an aggressive clinical evolution and resistance to tyrosine kinase inhibitor therapy. Due to the very small number of cases described in literature, therapeutic decisions are still difficult for patients displaying these abnormalities Rezumat Coexistenţa t(9;22) şi a inv(16) a fost descrisă într-un număr limitat de cazuri de LMC, LAM de novo sau LAM post chimioterapie. Raportăm un pacient cu LMC care a prezentat atât inversie de 16 cât şi cromozom Philadelphia şi care a evoluat spre criză blastică sub tratament cu Imatinib. Diagnosicul de laborator şi monitorizarea s-a realizat prin citometrie în flux, citogenetică convenţională şi tehnici de genetică moleculară. Inv(16), detectată prin cariotipare în clona Philadelphia pozitivă la momentul transformării blastice, a fost evaluată retrospective prin metoda real-time PCR, şi s-a dovedit a fi fost prezentă încă de la diagnostic. Biopsia de măduvă osoasă, efectuată în faza blastică a LMC, a confirmat prezenţa blaştilor aparţinând liniei mieloide, cu indicii de diferenţiere monocitoidă, frecvent asociată cu inv (16). De asemenea, cazul a asociat şi mutaţia F359V în domeniul kinazic al ABL, care determină rezistenţă intermediară la Imatinib şi Nilotinib, ceea ce a impus schimbarea terapiei cu Dasatinib. În cazul prezentat evoluţia a fost progresivă, urmată de deces ca urmare a lipsei de răspuns la inhibitorii de tirozin kinază, la 18 luni de la diagnosticare. Coexistenţa t(9; 22) şi inv(16) în LMC pare a fi asociată cu o evoluţie clinică agresivă şi rezistenţă la terapia cu inhibitori de tirozin kinază. Având în vedere numărul foarte mic de cazuri descrise în literatura de specialitate, deciziile terapeutice în cazul pacienţilor care prezintă aceste anomalii sunt încă dificile

Detection of chromosomal imbalances using combined MLPA kits in patients with syndromic intellectual disability

Abstract Intellectual disability (ID) is a common disorder, with major consequences for individual, family and society. Due to clinical and genetic heterogeneity of ID, in about 50% of cases an etiologic diagnosis cannot be established. The aim of this study was to evaluate the ability of a combination of MLPA kits to establish the diagnosis in 369 patients with syndromic ID and normal or uncertain routine karyotype results. All patients were assessed for chromosome imbalance using SALSA MLPA P064 or P096 kits, if the phenotype was suggestive of a microdeletion syndrome (subgroup A - 186 patients), or subtelomeric P036 and P070 kits, if the phenotype was not suggestive of a microdeletion syndrome or if the result of the standard karyotype was uncertain (subgroup B - 183 patients). Abnormal results detected by these kits were further characterized using appropriate follow-up MLPA kits (Telomere Follow-up set, P029-A1, P250-B2, ME028-B1). In subgroup A we identified 25 patients with microdeletions (13.4%). Using subtelomere screening and follow-up kits in subgroup B we detected cryptic rearrangements in 7.5% cases and identified the origin of the unknown material noticed in the standard karyotype in 10 out of 11 patients. Summarizing data from the two groups, the combined use of MLPA kits led to the diagnosis in 10.6% (38/358) patients with normal karyotype. Using follow-up MLPA kits allowed us both to confirm abnormalities and to determine their size, which facilitated the interpretation of the clinical significance of these rearrangements. For laboratories that do not have yet access to microarray technology, using several MLPA kits represents an effective strategy for establishing the diagnosis in ID patients. Rezumat Dizabilitatea intelectuală (DI) este o afecțiune frecventă, cu consecințe majore pentru individ, familie și societate. Datorită heterogenității sale clinice și genetice, în aproximativ 50% din cazuri etiologia bolii nu poate fi stabilită. Scopul acestui studiu a fost evaluarea capacității de stabilire a diagnosticului etiologic la 369 pacienți cu DI sindromic și rezultat normal sau incert la cariotip folosind o combinație de kituri MLPA. Toţi pacienţii au fost investigaţi prin metoda MLPA, folosind fie kiturile SALSA MLPA P064 sau P096, dacă fenotipul a fost sugestiv pentru un sindrom cu microdeleţie (subgrupul A - 186 pacienți), fie kiturile subtelomerice P036 și P070, dacă fenotipul nu a fost sugestiv pentru un sindrom cu microdeleţie sau rezultatul la cariotipul standard a fost incert (subgrupul B - 183 pacienți). Rezultatele anormale detectate de aceste kituri au fost caracterizate folosind kiturile MLPA corespunzătoare de urmărire (Telomere Follow-up set, P029-A1, P250-B2, ME028-B1). În subgrupul A am identificat 25 de pacienți cu microdeleții (13,4%). Folosind kiturile de screening subtelomeric și de urmărire la subgrupul B am detectat rearanjări criptice în 7,5% din cazuri și am identificat originea materialului suplimentar observat la cariotipul standard la 10 din 11 pacienți. Sumarizând datele obţinute din cele două loturi, folosirea combinată a seturilor MLPA a dus la stabilirea diagnosticului la 10,6% (38/358) dintre pacienții cu cariotip normal. Folosirea seturilor MLPA de urmărire a permis atât confirmarea prezenţei anomaliei, cât şi determinarea dimensiunii ei, ceea ce a facilitat interpretarea semnificaţiei clinice a rearanjărilor. Pentru laboratoarele care nu au acces la tehnologiile bazate pe microarray, folosirea mai multor kituri MLPA reprezintă o strategie eficientă pentru stabilirea diagnosticului etiologic la pacienţii cu DI.

Identification of Exonic Copy Number Variations in Dystrophin Gene Using Mlpa / Identificarea Variaţiilor Numărului de Copii în Gena Distrofinei Folosind Metoda Mlpa

Abstract Duchenne and Becker muscular dystrophies (DMD/BMD) are X-linked progressive muscle disorders determined by mutations of the dystrophin (DMD) gene. Multiplex Ligation - Dependent Probe Amplification (MLPA) is a simple, inexpensive and reliable test for molecular diagnosis of DMD gene mutations. It identifies exonic copy number variations in the DMD gene, but the test should be completed with sequencing analysis in case of single exon deletions/duplications. The aim of this study was to evaluate the efficiency of MLPA as a DMD mutation screening tool in affected males and carrier females, as well as to appreciate the frequency of different types of mutations and to check the validity of the “reading frame rule”. We have used MLPA for the detection of deletions/ duplications in DMD gene in 53 individuals (30 affected males and 23 asymptomatic female relatives) referred for evaluation and genetic counseling due to the clinical suspicion of DMD/BMD. In the affected males (21 DMD and 9 BMD) MLPA had a detection rate of 63.5% (53.5% deletions and 10% duplications). The most frequently deleted exon was exon 45 and the most frequent duplication involved exons 3-5, confirming the presence of the two hotspot mutation regions reported in the literature. Mutations detected in our study have a slightly different location compared to literature data. Reading frame rule was valid in 84% of our cases. Rezumat Distrofiile musculare Duchenne şi Becker (DMD/BMD) sunt boli musculare progresive legate de X determinate de mutaţii în gena distrofinei (DMD). Multiplex Ligation - Dependent Probe Amplification (MLPA) este o metodă simplă, necostisitoare şi precisă pentru diagnosticul molecular al mutaţiilor genei DMD. Ea identifică variaţiile numărului de copii în gena distrofinei, dar trebuie completată cu secvenţierea genei în cazul identificării deleţiilor/duplicaţiilor unui singur exon. Scopul acestui studiu a fost de a evalua eficienţa MLPA ca test de screening al mutaţiilor în gena DMD la indivizii afectaţi şi femeile purtătoare, dar şi de a aprecia frecvenţa diferitelor tipuri de mutaţii şi de a verifica valabilitatea “regulii cadrului de lectură. Am folosit MLPA pentru detectarea deleţiilor/ duplicaţiilor în gena DMD la 53 indivizi (30 băieţi afectaţi şi 23 rude asimptomatice de sex feminin) trimişi pentru evaluare şi sfat genetic datorită suspiciunii clinice de DMD/BMD. La băieţii afectaţi (21 DMD şi 9 BMD) MLPA a avut o rată de detecţie de 63,5% (53,5% deleţii şi 10% duplicaţii). Cel mai frecvent deletat exon a fost exonul 45 şi cea mai frecventă duplicaţie a implicat exonii 3-5, confirmând prezenţa celor două regiuni critice mutaţionale raportate în literatură. Mutaţiile detectate în studiul nostru au avut o localizare uşor diferită comparativ cu datele din literatură. Regula cadrului de lectură a fost valabilă în 84% din cazuri.